1、植物組織DNA的提取、分離 基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：82009年11月2日11、學(xué)習(xí)并掌握用CTAB法提取植物總DNA的 原理和方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)并掌握核酸組分的分離技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳方法2 核酸在植物體內(nèi)多與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白的形式存在，因此提取分離核酸時(shí)，必須使核酸與蛋白質(zhì)解離，并除去蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)。 本實(shí)驗(yàn)先將植物材料速凍、研磨，破碎細(xì)胞壁，然后加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）分離緩沖液，使細(xì)胞膜破裂，同時(shí)將核酸與蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)分開(kāi)。一定濃度的CTAB與核酸結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物溶于高濃度的鹽溶液，（而在低鹽溶液中沉淀）再經(jīng)氯仿異戊醇抽提、離心，除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，

2、上清液中加入異丙醇，沉淀DNA，而CTAB溶于異丙醇。二、實(shí)驗(yàn)原理:3 瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖或優(yōu)質(zhì)瓊脂粉作支持介質(zhì)的一種電泳分離方法。它主要用于大于或等于1Kb 核酸的分離。有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。其遷移率的大小，主要與DNA分子大小和空間構(gòu)象有關(guān)。其次，凝膠濃度、電泳電壓、PH值也會(huì)影響遷移率。核酸區(qū)帶觀察，是利用核酸與EB結(jié)合，在紫外光下可發(fā)出橙黃色熒光的性質(zhì)，借助于紫外觀測(cè)儀來(lái)進(jìn)行。41、實(shí)驗(yàn)材料：三葉草葉片2、儀器： (1)電熱恒溫水浴鍋 (2)離心機(jī) (3)液氮罐 (4)研缽等 三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：5 3、試劑：（1）CTAB分離緩沖液： 2%CTAB，1.4M NaCl，

3、 20mM EDTA，100mM Tris-HCl (pH8.0),0.2%巰基乙醇共100ml （2）洗滌緩沖液：75%乙醇，100mM 乙酸銨共100ml （3）氯仿：異戊醇24：1（V/V）（4）異丙醇 （5）TE液 （6）液氮 （7）EB液（8）電泳緩沖液TBE（9）凝膠加樣緩沖液6（一）植物組織DNA的提?。?1、取10mlCTAB分離緩沖液加入離心試管中，于60水浴預(yù)熱。2、稱(chēng)取1.5g新鮮葉片于預(yù)冷的研缽中，加入液氮，迅速將葉片研磨成很細(xì)的粉末。3、將葉片粉末直接加入預(yù)熱的CTAB分離液中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，60水浴保溫30分鐘。4、將液體轉(zhuǎn)入小燒杯中，加入等體積的氯仿異戊醇，輕輕搖

4、勻后，分裝到兩個(gè)離心管中，等重，4000r/min，離心8分鐘。5、用大開(kāi)口滴管取出上層水相于另一潔凈的離心管中，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，使DNA沉淀，并與CTAB分離。（注意現(xiàn)象）四、實(shí)驗(yàn)步驟： 76、收集DNA：（1）如呈可見(jiàn)的絲狀DNA，可用玻璃棒（或小勺）輕輕攪起。 （2）如呈云霧狀，再2000r/min離心4min，小心倒去上清液。7、洗滌：（1）將絲狀DNA直接轉(zhuǎn)移到15ml的洗滌緩沖液中洗30分鐘（如不能攪起，可2000r/min離心10分鐘，轉(zhuǎn)速不宜太高，否則形成堅(jiān)實(shí)的沉淀）； （2）在松散的沉淀物上加入15ml洗滌液，洗滌30分鐘，用玻璃棒輕輕攪起沉淀。8、保存

5、：將DNA從離心管中取出，于濾紙上干燥后溶于1mlTE中，低溫保存?zhèn)溆谩?(二）DNA組分的分離瓊脂糖凝膠電泳1、瓊脂糖凝膠的制備：以5 X TBE電泳緩沖溶液配制，濃度為0.7% 。將瓊脂糖粉和TBE液于沸水浴中加熱至完全溶解，待冷卻至60左右時(shí)加入EB，使EB終濃度為0 .5mg / ml 。2、凝膠板的制備： A、在膠床的兩頭貼上膠帶，形成8mm 高的擋 墻，壓緊膠帶，置于水平臺(tái)面上。 B、插入梳子，梳子下端距底板0 .5-1mm ，然后將凝膠不間斷地倒入膠床，高3-4mm ，避免產(chǎn)生氣泡，在室溫下凝固。9 C、完全凝固后撕去膠帶，于電泳槽中加入電泳緩沖溶液，高于膠面1mm，從一端斜拉出梳子，除去產(chǎn)生的氣泡。3、加樣：將樣品DNA溶液與加樣緩沖溶液 以5：1體積混合，加樣量每孔5-10 ul。4、電泳：陽(yáng)向極電泳。電位5V/cm ，當(dāng)染料 前沿移至底邊1-2 cm 處時(shí),停止電泳。5、觀察：將膠床置紫外檢測(cè)儀上觀察并記 錄。10五、思考題： 1、提取核酸時(shí)應(yīng)注意些什么問(wèn)題？2、EB在對(duì)核酸進(jìn)行染色時(shí)有什么優(yōu)點(diǎn)？其原理如何？3、用中文命名：CTAB、EB。 111、核酸提取過(guò)程中的注意事項(xiàng)：（1）避免過(guò)酸過(guò)堿或高溫環(huán)境，合適的T：04， pH4-9；（2）防止機(jī)械力的切割作用