1、白花蛇舌草乙醇提取物對肺腺癌A549細(xì)胞株增殖和凋亡的影響高寶安，陳世雄，楊俊，黃驥，鄧紅艷【關(guān)鍵詞】白花蛇舌草乙醇提取物細(xì)胞周期凋亡人肺腺癌A549細(xì)胞原發(fā)性支氣管肺癌是如今最常見的惡性腫瘤之一。近30年來，其發(fā)病率和殞命率在天下范疇內(nèi)呈上升趨勢。肺腺癌在原發(fā)性支氣管肺癌中極為常見，傳統(tǒng)化療和放療對肺腺癌結(jié)果均不甚抱負(fù)1。白花蛇舌草Hedytisdiffusa為茜草科耳草屬植物。中醫(yī)以其全草入藥，性寒，味甘淡，歸心、肺、肝、大腸經(jīng)；清熱解毒，利尿；主治惡瘡腫毒、瀉痢等癥，臨床常用于治療各種癌癥2。研究表白3，差異工藝白花蛇舌草提取物抗腫瘤作用有差異：乙醇提取物冷水提取物煎煮提取物。我們通過研

2、究白花蛇舌草乙醇提取物對肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響，展現(xiàn)白花蛇舌草抗肺腺癌大概的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論根據(jù)。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1藥物和試劑白花蛇舌草購于湖北省藥材公司。取白花蛇舌草全草50g，破壞研磨，95%乙醇攪拌浸泡15d，濾去殘?jiān)≈烈后w全部蒸發(fā)干，此后參加ddH250l溶解，得到生藥濃度為1g/l，0.22濾膜過濾除菌，4保存，用前用DE造就基稀釋至所需濃度。碘化丙啶PI購于Pharingin公司晶美公司署理。Hhest33258購于Siga公司。鼠抗人Bax、Bl-2及-atin單抗購自美國Santaruz公司。1.2細(xì)胞及其造就肺腺癌細(xì)胞株A549購于武漢大學(xué)中國典

3、范造就物收藏中央，用含10小牛血清杭州四序青生物工程質(zhì)料的DE造就基Gib公司，在含52、37飽和濕度的造就箱中造就，0.25胰卵白酶消化傳代。1.3TT試驗(yàn)A549細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)解細(xì)胞密度為1105l-1，接種于96孔板，每孔100l。分設(shè)比擬組和差異濃度藥物組5，10，20，40，80g/l，每孔設(shè)6復(fù)孔，別離造就1，2，3，4d；每孔參加5g/LTT10l，繼承孵育4h，每孔參加200l二甲基亞砜DS停頓，振蕩15in，450型ELISA-Reader酶標(biāo)儀Bi-Rad公司570n主波長，630n副波長檢測吸光度。以比擬組細(xì)胞活力為100，按公式盤算差異濃度白花蛇舌草乙醇提取物

4、對A549細(xì)胞增殖的按捺率：細(xì)胞按捺率%(1藥物組吸光度/比擬組吸光度)1001.4Hehst33258染色檢測細(xì)胞凋亡按照TT實(shí)行結(jié)果，選擇40g/l的白花蛇舌草乙醇提取物作為后續(xù)實(shí)行藥物濃度。將干凈無菌的蓋玻片置于六孔板內(nèi)，接種細(xì)胞留宿。當(dāng)5080滿時(shí)，參加白花蛇舌草乙醇提取物作用12，24，36，48h后，吸盡造就液，參加0.5l的結(jié)實(shí)液，結(jié)實(shí)10in。然后去結(jié)實(shí)液，用PBS洗兩次，3in/次，吸盡液體，參加0.5lHehst33258染色液1g/l，染色5in，晃動數(shù)次，封片，熒光顯微鏡下不雅察。1.5流式細(xì)胞儀闡發(fā)細(xì)胞周期和凋亡率將A549細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞生長至75交融擺布，

5、比擬組參加DE造就基，實(shí)行組參加白花蛇舌草乙醇提取物40g/l，作用0，12，24，36，48h后，胰酶消化網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞，PBS洗滌后，80冰乙醇結(jié)實(shí)，20留宿。檢測前PBS沖洗細(xì)胞1次，調(diào)解細(xì)胞濃度為106l-1，參加含RnaseA終濃度為0.25g/l的碘化丙啶PI染色液終濃度為5g/l中，室溫避光染色30in，流式細(xì)胞儀購自BehanDiksn公司檢測，每組重復(fù)3次，ellQuest及tift軟件闡發(fā)SubG1峰和細(xì)胞周期。1.6卵白免疫印跡試驗(yàn)esternBlt網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞，參加細(xì)胞裂解液，冰上安排15in，12000r/in離心15in，取上清，以Bradfrd法作卵白質(zhì)定量后置80貯存?zhèn)溆?/p>

6、。灌制10SDS-聚丙烯酰胺凝膠，通例電泳，轉(zhuǎn)膜，關(guān)閉，一抗1500，4孵育留宿，二抗15000，室溫孵育2h，EL顯色。圖像經(jīng)UvpgrabitIage軟件測定各條帶的吸光度，以各條帶的吸光度值與-atin吸光度值的比值舉行細(xì)胞間卵白表達(dá)量的比力。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)全部數(shù)據(jù)均用s表現(xiàn)，利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0進(jìn)配對資料t查驗(yàn)，P0.05為差異有明顯性意義。2結(jié)果2.3白花蛇舌草乙醇提取物對A549細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響40g/l的白花蛇舌草乙醇提取物作用于A549細(xì)胞12，24，36，48h，通過亞G1峰檢測其凋亡率別離為5.720.98%，7.102.08%，19.894.25%，3

7、2.556.51%，與比擬組細(xì)胞凋亡率比擬，差異有明顯性P均0.05。細(xì)胞周期檢測結(jié)果表現(xiàn)，40g/l的白花蛇舌草乙醇提取物作用A549細(xì)胞后，G1G0期細(xì)胞百分比漸漸增高，從0h的36.345.15%，升高到48h的64.947.56%。結(jié)果見表1和圖3。表140g/l白花蛇舌草乙醇提取物對A549細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的影響略2.4esternBlt檢測結(jié)果40g/l的白花蛇舌草乙醇提取物作用A549細(xì)胞0，12，24，36，48h，esternBlt檢測Bax的表達(dá)漸漸增長，Bl-2的表達(dá)漸漸減低。結(jié)果見圖4。3討論經(jīng)Hehst33258染色及流式細(xì)胞儀檢測，白花蛇舌草乙醇提取物作用A54

8、9細(xì)胞，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，40g/l白花蛇舌草乙醇提取物作用A549細(xì)胞12，24，36，48h后，凋亡率別離為5.720.98%，7.102.08%，19.894.25%，32.556.51%，均高于比擬組P均0.05，且凋亡率隨藥物作用時(shí)間增長而增長。凋亡的線粒體通路重要由Bl-2家屬成員所調(diào)控，該家屬可分為兩個(gè)亞群：一個(gè)亞群Bl-2，Bid，Bl-x，Bl-等抗凋亡卵白構(gòu)成；另一個(gè)亞群由Bax，Bak，Bik，Bl-xs等促凋亡分子構(gòu)成9。本實(shí)行檢測了Bax和Bl-2卵白程度的變革環(huán)境，白花蛇舌草乙醇提取物作用A549細(xì)胞，Bax卵白程度漸漸表達(dá)升高，Bl-2卵白程度表達(dá)漸漸減低，表白

9、凋亡是通過促凋亡分子Bax的上調(diào)和抗凋亡分子Bl-2的下調(diào)來實(shí)現(xiàn)的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1El-SharuniSY，KalHB，BatterannJJ，etal.Sequentialversusnurrenthe-raditherapyininperablestageIIInn-sallelllunganerJ.AntianerRes，2022，26(1B):495.2宋立人.中華本草，第1版.上海：上?？茖W(xué)技能出書社，1999：433.3趙浩如，李瑞，林以寧，等.白花蛇舌草差異提取工藝對抗腫瘤活性的影響J.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，336：510.4TaI，ShrieverF，DrkenB.App

10、tsis:ipliatinsfbasiresearhfrlinialnlgyJ.Lanetnl.2001，2(1):33.5SykitisGP，PapavassiliuAG.Apptsis:thesuiideslutininanertreatentandhepreventinJ.ExpertpinInvestigDrugs.2022，15(6):575.6Lin，NgLT，YangJJ.Antixidantativityfextratsfpeh-hue-jua-hi-ainaellfreesysteJ.AJhined.2022，32(3):339.7GuptaS，ZhangD，YiJ，etal.AntianerativitiesfldenlandiadiffusaJ.