1、Decorin基因轉(zhuǎn)染對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 劉波，王川，胡在敏，季文，菜璨，亢渝俊，姜政(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400016)【摘要】目的：探討核心蛋白聚糖（Decorin，DCN)基因轉(zhuǎn)染對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及腫瘤血管生成的影響。方法：構(gòu)建裸鼠胃癌移植瘤模型，將重組質(zhì)粒PEGFP-N1-DCN注入腫瘤中央及基底部，以空質(zhì)粒組和生理鹽水組作為對(duì)照，測(cè)量腫瘤體積和質(zhì)量的變化，RT-PCR及Western blot檢測(cè)DCN的表達(dá)差異，免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VE

2、GF)的表達(dá)差異。結(jié)果：裸鼠胃癌移植瘤模型構(gòu)建成功，與對(duì)照組比較，重組質(zhì)粒組腫瘤生長(zhǎng)速度減慢，腫瘤體積和質(zhì)量明顯變小(P0.05)；RT-PCR顯示重組質(zhì)粒組DCN表達(dá)明顯增強(qiáng)，Western blot顯示重組質(zhì)粒組有融合蛋白的表達(dá)；免疫組化顯示重組質(zhì)粒組VEGF表達(dá)降低（P0.05)。結(jié)論：DCN基因可以抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，抑制腫瘤新生血管形成可能是其抗腫瘤作用的機(jī)制之一。【關(guān)鍵詞】核心蛋白聚糖；轉(zhuǎn)染；胃癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子【中圖分類(lèi)號(hào)】R735.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】Effect of decorin gene transfection on human gastric carcinoma x

3、enograft growth in nude miceLiu Bo，Wang Chuan， Hu Zaimin，Ji Wen，Cai Can， Kang Yujun，Jiang Zheng (Department Of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital Of Chongqing Medical University,Chongqing 400016)Abstract Objective: To investigate the effect of decorin gene transfection on the growth and

4、angiogenesis of nude mice xenograft which bearing human gastric carcinoma cell SGC-7901. Methods: Gastric carcinoma xenograft model in nude mice was established, recombinant plasmid PEGFP-N1-DCN was injected to the center and bottom of the carcinoma, empty plasmid group and physiological saline grou

5、p as control groups, the change of carcinoma volume and weight was measured, the different expression of DCN was detected by RT-PCR and western blot, the different expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) was assessed by immunohistochemistry. Results: Gastric carcinoma xenograft model

6、 in nude mice was constructed successfully, compared with the control groups, slower growth speed, smaller volume and lighter weight was found in recombinant plasmid group (P0.05), RT-PCR showed that the expression of decorin gene in recombinant plasmid group was significantly higher than control gr

7、oups, western blot indicated that the expression of fusion protein was found in recombinant plasmid group, immunohistochemistry showed that the expression of VEGF was down-regulated in recombinant plasmid group (P0.05). Conclusion: Decorin gene can inhibit the 作者單位：400016 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科通訊作者：姜政，gro

8、wth of nude mice xenograft, inhibition of angiogenesis may be one of the mechanism for antitumous effect.Key Words Decorin;Transfection;Gastric cancer;Vascular Endothelial Growth Factor胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居我國(guó)消化道腫瘤的第一位，目前胃癌主要通過(guò)手術(shù)、化療等方式進(jìn)行治療，但由于早期診斷率低，治療效果欠佳，因此基因治療為胃癌的治療提供了新的思路。DCN屬于細(xì)胞外基質(zhì)成分，主要分布在結(jié)締組織中，是一種細(xì)胞生長(zhǎng)

9、的負(fù)性調(diào)節(jié)劑。此前我們已經(jīng)成功構(gòu)建PEGFP-N1-DCN重組質(zhì)粒，為下一步工作奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染DCN基因,觀察該基因的高表達(dá)對(duì)裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)的影響，檢測(cè)其對(duì)腫瘤血管生長(zhǎng)的作用，初步探討DCN基因在腫瘤治療中的作用及可能機(jī)制。1材料和方法1.1材料Balb/c-nu裸鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，pEGFP-N1質(zhì)粒、E.coliDH5和SGC-7901胃癌細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院向廷秀博士惠贈(zèng)，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒均購(gòu)于大連TaKaRa公司、質(zhì)粒小量提取試劑盒及無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)

10、Omega公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司，兔抗人VEGF多克隆抗體購(gòu)自德國(guó)DATASHEET公司，兔抗人Decorin抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，免疫組化試劑盒購(gòu)自北京百奧泰斯生物科技有限公司。1.2方法 1.2.1重組質(zhì)粒的鑒定 將前期已經(jīng)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-DCN進(jìn)行雙酶切（EcoR I和BamH I），酶切反應(yīng)結(jié)束后加入10loading Buffer終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。1.2.2動(dòng)物模型的建立及分組 將用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在37，5%CO2孵箱內(nèi)的SGC-7901胃癌細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后離心，用PBS清洗2次，

11、將細(xì)胞團(tuán)塊吹散，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色證實(shí)細(xì)胞活力95%,胃癌細(xì)胞最終濃度為1107/ml。取細(xì)胞2106個(gè)(0.2 ml) 接種于裸鼠背部皮下組織內(nèi)，動(dòng)物飼養(yǎng)于層流罩內(nèi)約4周，待腫瘤長(zhǎng)至約7 mm4 mm4 mm (約50 mm3)時(shí)隨機(jī)分為3組，即生理鹽水組,空質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒組，每組6只裸鼠，進(jìn)行瘤內(nèi)給藥。具體方法是生理鹽水組注射200 l生理鹽水，空質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒組注射質(zhì)粒量為20 g/只1(按脂質(zhì)體體積: DNA質(zhì)量為2.5:1包裹并加入適量的不含血清的1640培養(yǎng)液混合)，終體積均為200 l，將200 l混合液向腫瘤基底部3點(diǎn)以及中央1點(diǎn)注射，每3 d注射一次，24 d后斷頸處死裸鼠，部

12、分瘤組織用于勻漿提取總RNA，部分用于碾碎提取總蛋白，剩余部分用于制作石蠟切片。1.2.3腫瘤體積與瘤重分析 注射質(zhì)粒前按公式V = 0.5ab2 (V代表腫瘤體積，a為長(zhǎng)徑，b為短徑)監(jiān)測(cè)裸鼠腫瘤體積，每3 d測(cè)量一次，繪制腫瘤體積增長(zhǎng)曲線(xiàn)，24 d后斷頸處死裸鼠，分離得瘤體，稱(chēng)重并繪制腫瘤質(zhì)量差異圖。1.2.4半定量RT-PCR檢測(cè)DCN的表達(dá)差異 按照Trizol試劑盒操作說(shuō)明提取腫瘤組織總RNA，所提總RNA溶于30 l無(wú)酶水中，Eppendorf核酸定量測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度和純度，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA完整性，將所提總RNA行RT-PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為94預(yù)變性5

13、min，94變性30 s，60退火30 s，72延伸70 s，35個(gè)循環(huán)，72穩(wěn)定5 min，4冷卻保存。DCN的上游引物為5-CGGAATTCACATGAAGGCCACTATCATCCT-3，下游引物為5-CGGGATCCTTATAGTTTCCGAGTTGAATG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1080 bp，內(nèi)參-actin上游引物為5-ACTGTGCCCATCTACGAGG-3，下游引物5-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為678 bp，所用引物均由上海生工合成。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像儀上觀察拍照，運(yùn)用Quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行光密度掃描

14、，檢測(cè)各組DCN擴(kuò)增產(chǎn)物與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參-actin擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值，然后將比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.2.5 Western blot檢測(cè)DCN的表達(dá)差異 將部分裸鼠腫瘤組織勻漿碾碎，提取全細(xì)胞總蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，取50 g蛋白上樣，進(jìn)行SDS凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，封閉2 h后，以兔抗人DCN抗體及兔抗人tubulin-抗體為一抗4孵育過(guò)夜，次日以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑BeyoECL Plus顯色，暗盒壓片，顯影定影，最后應(yīng)用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相，采用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析。 1.2.6免疫組化檢測(cè)V

15、EGF的表達(dá)差異 24 d后斷頸處死裸鼠，分離得瘤體，將腫瘤組織以4%甲醛固定，制成石蠟切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。VEGF免疫組化結(jié)果判定：觀察棕黃或棕褐色顆粒的分布情況，有棕黃或棕褐色顆粒且強(qiáng)度高于背景的非特異性著色為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)無(wú)棕黃或棕褐色顆粒為陰性細(xì)胞。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SD表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析，P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P0.01表示有顯著的差異，P0.05表示差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-DCN雙酶切后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒雙酶切可見(jiàn)兩個(gè)

16、條帶，大片段與載體大?。?700 bp）一致，小片段與目的基因大?。?080 bp）一致，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1）。211000bp4000bp10000bp1080bp4700bp 圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果 1：DNA標(biāo)準(zhǔn)10000；2：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物2.2裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)和腫瘤體積與質(zhì)量分析 人胃癌細(xì)胞SGC-7901接種 24 d28 d后全部裸鼠皮下成瘤，待腫瘤體積長(zhǎng)至約50 mm3時(shí)，分別向3組裸鼠腫瘤組織注入等量的生理鹽水,空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒，每隔3 d天重復(fù)一次，共8次，每次注射前測(cè)量腫瘤體積并記錄，最后繪制腫瘤體積增長(zhǎng)曲線(xiàn)(圖2)，24 d后斷頸處死裸鼠，分離得瘤體并

17、稱(chēng)重，繪制腫瘤質(zhì)量差異圖（圖3）。 圖2 不同處理方法后的移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn) 圖3 不同處理方法后的移植瘤質(zhì)量差異 2.3RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá) 將3組腫瘤組織RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組DCN的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而空質(zhì)粒組和生理鹽水組DCN表達(dá)微弱且無(wú)明顯差異，說(shuō)明重組質(zhì)粒在腫瘤組織中表達(dá)成功（圖4）。 4321750bp2000bp678bp1080bp 圖4 RT-PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒在腫瘤組織中的表達(dá) 1：DNA標(biāo)準(zhǔn)2000；2：生理鹽水組；3：空質(zhì)粒組；4：重組質(zhì)粒組2.4Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá) 分別提取3組腫瘤組織總蛋白后行Wes

18、tern blot檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光試劑顯色后可見(jiàn)3組細(xì)胞Tubulin-條帶均清晰，DCN蛋白分子量約為40KDa，GFP分子量約為27KDa，融合蛋白GFP/DCN分子量約為67 KDa，本實(shí)驗(yàn)中重組質(zhì)粒組在67 KDa處見(jiàn)一條帶，而空質(zhì)粒組和生理鹽水組均無(wú)此條帶，說(shuō)明重組質(zhì)粒在腫瘤組織中成功表達(dá)融合蛋白（圖5）。321融合蛋白67KDa DCN Tubulin-40kDa49KDa 圖5 Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒在腫瘤組織中的表達(dá) 1：生理鹽水組；2：空質(zhì)粒組；3：重組質(zhì)粒組2.5免疫組化檢測(cè)VEGF在腫瘤組織中的表達(dá) 光學(xué)顯微鏡下觀察，VEGF陽(yáng)性染色為棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，

19、重組質(zhì)粒組裸鼠移植瘤VEGF表達(dá)較生理鹽水組和空質(zhì)粒組均降低（P0.05 )(圖6）。 321 圖6 免疫組化檢測(cè)VEGF在腫瘤組織中的表達(dá) 1：生理鹽水組；2：空質(zhì)粒組；3：重組質(zhì)粒組 3討論 DCN屬于細(xì)胞外富含亮氨酸的小分子PG家族（Smallleucine-m-rich proteoglycans, SLRPS），由糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)鏈共價(jià)連接于核心蛋白（Core protein）所組成的大分子糖復(fù)合物，其代謝異?；蚪Y(jié)構(gòu)改變與許多疾病的病理過(guò)程有著密切的關(guān)系。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，我們著重研究的是DCN作為一種細(xì)胞生長(zhǎng)負(fù)性調(diào)節(jié)因子從而對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖均有抑

20、制作用，同時(shí)它還可以降低細(xì)胞的遷移、侵襲能力。國(guó)內(nèi)外的一些學(xué)者利用不同的方法克隆DCN基因，并將其與不同的載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)染入不同的細(xì)胞或組織內(nèi)以研究其功能2-4。真核表達(dá)載體pEGFP-N1的多克隆位點(diǎn)位于CMV的啟動(dòng)子與綠色熒光蛋白編碼序列之間，CMV啟動(dòng)子可以增強(qiáng)DCN基因的表達(dá)，同時(shí)綠色熒光蛋白的表達(dá)能夠清楚的顯示真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染情況，pEGFP-N1-DCN重組質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白兼具有DCN和EGFP蛋白的活性，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，同時(shí)便于轉(zhuǎn)染后觀察5-6，所有這些都為我們后續(xù)所做的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為我們進(jìn)一步研究DCN基因的功能提供了有力的科學(xué)依據(jù)。 腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移具有明確

21、的血管依賴(lài)性7，如果沒(méi)有新生血管的形成，腫瘤細(xì)胞只能靠周?chē)M織的彌散而獲得O2和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其生長(zhǎng)將受到明顯限制，一旦在瘤灶內(nèi)及其周?chē)纬尚律?，腫瘤細(xì)胞就可經(jīng)新生血管運(yùn)輸獲得充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而迅速生長(zhǎng)，并通過(guò)血液循環(huán)把腫瘤細(xì)胞運(yùn)輸?shù)狡渌课?，有研究表明，抗腫瘤血管生成能抑制結(jié)腸癌8、肺癌9、鼻咽癌10等惡性腫瘤的生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生的VEGF是重要的促血管生長(zhǎng)因子，其可通過(guò)與其受體VEGFR1、VEGFR2結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，增加微血管通透性，加速血漿蛋白外滲，最終導(dǎo)致新的基質(zhì)及新生血管腔形成。因此，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法將血管生成抑制因子轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞或組織

22、，就可以在腫瘤細(xì)胞或周?chē)M織創(chuàng)造抑制血管生成的微環(huán)境11，從而有效抑制腫瘤生長(zhǎng)12-13。在本實(shí)驗(yàn)中，我們成功構(gòu)建了裸鼠胃癌移植瘤模型，觀察轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對(duì)裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)的影響，并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行了初步探討。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒組腫瘤生長(zhǎng)速度較對(duì)照組減慢，裸鼠移植瘤生長(zhǎng)受到一定程度抑制，而后我們采用了免疫組化方法觀察DCN基因高表達(dá)對(duì)胃癌組織VEGF表達(dá)的影響，結(jié)果表明DCN抑制了腫瘤組織中VEGF的表達(dá)，這可能也是DCN發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵機(jī)制之一。參考文獻(xiàn)：1 Gao LF, Zhang L, Hu JD, et al. Down-Regulation of signal transduc

23、er and activator of transcription 3 expression using vector-based small interfering RNAs suppresses growth of human prostate tumor in vivoJ. Clinical Cancer Research, 2005, 11(1): 6333-6341.2 Wu H, Wang S, Xue A, et al. Overexpression of decorin induces apoptosis and cell growth arrest in cultured r

24、at mesangial cells in vitroJ. Nephtology(catlton), 2008, 13(7): 607-615.3 趙春霞,趙萌濤,汪培華. 重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)核心蛋白聚糖基因轉(zhuǎn)染對(duì)Siha細(xì)胞周期和凋亡的影響J.癌癥, 2005, 24(1) : 28-324 RR Mohan, WM Stapleton, S Sinha, et al. Gene transfer into keratocytes inhibits alpha smooth muscle actin(SMA) expression and myofibroblast transformati

25、on invest Invest OphthalmalJ. Vis Sci,2006,47:18155 黃波,田大力,楊春鹿. ABCE1基因pEGFP重組表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌J. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2009;17(3):393-3976 馬俊,陳明浩,竇科峰,等. pEGFP-N1-linamarase重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及l(fā)inamarase在MH-CC97中的表達(dá)J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(7):577-580 7 Staton CA,Stribbling SM,Tazzyman S,et al. Current methods for assaying angioge

26、nesis in vitro and in vivo. Int J Exp Pathol,2004,85:233-2488 Dkhissi F,Lu H,Soria C,et al. Endostatin exhibits a direct antitum or effect in addition to its antiangiogenic activity in colon cancer cells. Hum Gene Ther,2009,14:997-10089 Kurdow R,Boehle AS,Ruhnke M,et al. Retroviral endostatin gene tra