1、病毒感染的檢查方法與防治原則醫(yī)學(xué)病毒感染的檢查方法與防治原則醫(yī)學(xué)內(nèi) 容第一節(jié) 病毒感染的診斷(檢查方法）第二節(jié) 病毒感染的特異性預(yù)防(自學(xué)）第三節(jié) 病毒感染的治療（自學(xué)）內(nèi) 容第一節(jié) 病毒感染的診斷(檢查方法）第一節(jié) 病毒感染的診斷（Diagnosis of viral infection） 標(biāo)本采集與送檢原則 病毒感染的檢查方法第一節(jié) 病毒感染的診斷 標(biāo)本采集與送檢原則一、標(biāo)本采集與送檢原則 按疾病種類(lèi)與病程采取不同標(biāo)本 在發(fā)病早期與用藥之前采取標(biāo)本 無(wú)菌操作，有菌標(biāo)本用“雙抗”（青、鏈霉素）或 “三抗”（青、鏈霉素+兩性霉素B）處理 冷藏速送，病變組織用50甘油保存 血清學(xué)檢測(cè)：IgM 單

2、份血清, IgG 雙份血清 一、標(biāo)本采集與送檢原則 按疾病種類(lèi)與病程采取不同標(biāo)本二、檢查方法 病毒的形態(tài)學(xué)檢查 病毒的血清學(xué)檢查 病毒的分子生物學(xué)檢查 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定二、檢查方法 病毒的形態(tài)學(xué)檢查1. 病毒形態(tài)學(xué)檢查電子顯微鏡：可觀察各種病毒的形態(tài) 但設(shè)備貴、操作復(fù)雜，應(yīng)用受限光學(xué)顯微鏡：可觀察大病毒（痘病毒）和包涵體 對(duì)一般病毒檢測(cè)意義不大1. 病毒形態(tài)學(xué)檢查電子顯微鏡：可觀察各種病毒的形態(tài)呼腸病毒感染回腸上皮細(xì)胞電鏡照片Electronmicrographs呼腸病毒感染回腸上皮細(xì)胞電鏡照片ElectronmicrogInclusion bodyCytomegalic cell tha

3、t contains a dense, owls eye, acidophilic intranuclear inclusion body Negry bodyInclusion bodyCytomegalic cell2. 病毒血清學(xué)檢查 已知抗原測(cè)抗體（診斷） 已知抗體測(cè)抗原（鑒定病毒屬、種、 型、亞型）2. 病毒血清學(xué)檢查 已知抗原測(cè)抗體（診斷）(1) 中和試驗(yàn)(Neutralization test)(2) 血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination inhibition test)(3) 免疫標(biāo)記法(FIA、EIA、RIA) 蛋白印跡(Western blot)2. 病毒血清學(xué)檢

4、查方法：(1) 中和試驗(yàn)(Neutralization test)2Immunofluorescense testImmunofluorescense testImmunofluorescense testPositive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC)Immunofluorescense testPositivHEL細(xì)胞中CMV IE1蛋白的表達(dá)Enzyme immunoassay (EIA)HEL細(xì)胞中CMV IE1蛋白的表達(dá)Enzyme immuELISAColoured wells indi

5、cate reactivityELISAColoured wells indicate rAIDS的確診試驗(yàn)Western blotAIDS的確診試驗(yàn)Western blot3. 病毒分子生物學(xué)檢查 可用于檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)不能培養(yǎng)的病毒 可用于檢測(cè)少量標(biāo)本或含少量病毒的標(biāo)本 可用于抗體產(chǎn)生前或不能產(chǎn)生抗體的免疫缺陷患者檢測(cè) 可對(duì)病毒進(jìn)行定量檢測(cè)，有助于療效監(jiān)測(cè) 可對(duì)病毒進(jìn)行基因分型 靈敏度高、特異性好、快速、簡(jiǎn)捷優(yōu)點(diǎn)：3. 病毒分子生物學(xué)檢查 可用于檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)不能培養(yǎng)的3. 病毒分子生物學(xué)檢查 核酸電泳(nucleic acid electrophoresis) 核酸雜交(nucleic

6、 acid hybridization) 核酸擴(kuò)增(PCR） 基因芯片(gene chip) 基因測(cè)序(gene sequence)方法：3. 病毒分子生物學(xué)檢查 核酸電泳(nucleic ac4. 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定: 病毒的分離培養(yǎng) 病毒的鑒定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定4. 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定: 病毒的分離培養(yǎng)病毒的分離培養(yǎng)方法： 動(dòng)物接種 雞胚培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng):病毒的分離培養(yǎng)方法： 動(dòng)物接種: 動(dòng)物接種(animal inoculation)動(dòng)物：鼠、兔、猴、黑猩猩等優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果易觀察，可建立動(dòng)物模型缺點(diǎn)：有飼養(yǎng)條件要求，費(fèi)用高、動(dòng)物 體內(nèi)常帶有潛伏病毒。 目前已很少應(yīng)用。 動(dòng)物接種(ani

7、mal inoculation)動(dòng)物：鼠 雞胚培養(yǎng)(embryonated egg culture)受精卵孵育10-12天雞胚接種病毒孵育2-7天收獲相應(yīng)的材料進(jìn)行鑒定 雞胚培養(yǎng)(embryonated egg culture雞胚接種部位：尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種雞胚接種部位：尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種優(yōu)點(diǎn)：易管理 不帶微生物 成本較低缺點(diǎn)：操作程序復(fù)雜目前用雞胚培養(yǎng)的病毒主要是流感病毒 雞胚培養(yǎng)(embryonated egg culture)優(yōu)點(diǎn)： 雞胚培養(yǎng)(embryonated egg cult(3) 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)根據(jù)細(xì)胞生

8、長(zhǎng)的方式分: 單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayer cell culture） 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（suspended cell culture）(3) 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的方根據(jù)細(xì)胞來(lái)源、染色體特征及傳代次數(shù)分: 原代培養(yǎng)細(xì)胞 二倍體細(xì)胞株 傳代細(xì)胞系或株(3) 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)根據(jù)細(xì)胞來(lái)源、染色體特征及傳代次數(shù)分:(3) 細(xì)胞培養(yǎng)(ce原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural cells)組織 組織塊 分散的單個(gè)細(xì)胞 單層細(xì)胞 剪碎 蛋白酶(原代細(xì)胞)單層細(xì)胞(次代細(xì)胞)傳代培養(yǎng)培養(yǎng)基原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural cells原

9、代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural cells)epithelial cells原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural cells特點(diǎn): 對(duì)多種病毒敏感 生長(zhǎng)能力有限, 獲取成本高 可攜帶潛伏病毒應(yīng)用: 病毒分離與鑒定 病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 不能用于制備疫苗原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural cells)特點(diǎn):原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural ce體外分裂50100代仍保持二倍染色體數(shù)目的單型細(xì)胞特點(diǎn): 對(duì)多種病毒敏感 不帶異種蛋白(人源性) 不帶病毒,無(wú)致瘤潛能應(yīng)用: 病毒分離與鑒定 病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 制備疫苗二倍體細(xì)胞株(diploid cell str

10、ain)fibroblastic cells體外分裂50100代仍保持二倍染色體數(shù)目的單型細(xì)胞特點(diǎn):傳代細(xì)胞系(continuous cell line )特點(diǎn): 對(duì)多種病毒敏感性高 繁殖能力強(qiáng),傳代時(shí)間長(zhǎng) 有致癌危險(xiǎn)(來(lái)源于癌細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞株)應(yīng)用: 病毒分離與鑒定 病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 不能用于制備疫苗能在體外無(wú)限傳代的細(xì)胞系。如 HeLa, Hep-2epithelioid cells傳代細(xì)胞系(continuous cell line )特4. 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定: 病毒的分離培養(yǎng) 病毒的鑒定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定4. 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定: 病毒的分離培養(yǎng)病毒鑒定： 病毒在細(xì)胞中

11、增殖的指標(biāo) 病毒形態(tài)學(xué)鑒定 病毒抗原鑒定 病毒基因鑒定病毒鑒定： 病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo) 細(xì)胞病變效應(yīng)( cytopathic effect,CPE) 病毒在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖引起的光鏡下可見(jiàn)的細(xì)胞病理改變。 細(xì)胞病變效應(yīng)( cytopathic effect,CPCPE：病毒感染細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變CPE：病毒感染細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變Syncytium formation in cell culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom). CPE：病毒感染細(xì) 胞與鄰近細(xì)胞融合Syncytium formation in cell cuCPE：

12、形成包涵體（inclusion body）CPE：形成包涵體（inclusion body）Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet. 紅細(xì)胞吸附（hemadsorption, HAd）受染細(xì)胞膜表面血凝素（HA） RBC表面HA受體Syncytial formation caused by 干擾現(xiàn)象（interference）風(fēng)疹病毒人胚腎細(xì)胞 病毒增殖，CPE（）?？刹《救伺吣I細(xì)胞 病毒增殖，CPE（）人胚腎細(xì)

13、胞風(fēng)疹病毒？埃可病毒CPE(-)?？刹《?-) 風(fēng)疹病毒(+) CPE(+)?？刹《?+) 風(fēng)疹病毒(-) 干擾現(xiàn)象（interference）風(fēng)疹病毒人胚腎細(xì)胞4. 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定: 病毒的分離培養(yǎng) 病毒的鑒定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定4. 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定: 病毒的分離培養(yǎng) 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定：蝕(空)斑形成試驗(yàn) 50%組織細(xì)胞感染量病毒總量(活病毒+死病毒)：感染性病毒量:血凝試驗(yàn) 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定：蝕(空)斑形成試驗(yàn) 病毒總量(活病毒蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaque assay） 原理：適當(dāng)濃度的感染性病毒在覆蓋瓊脂的細(xì)胞層上產(chǎn)生可見(jiàn)和可數(shù)的局部病灶稱(chēng)為蝕斑。一個(gè)蝕斑是由一

14、個(gè)感染性病毒顆粒增殖而形成的，由蝕斑的數(shù)目可以計(jì)算出原始標(biāo)本中感染性病毒的含量。蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaque assay） 原理：適當(dāng)PLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAY 分別為10-1、10-2、10-3倍稀釋度的HCMV病毒液感染的HEL細(xì)胞蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaque assay） 分別為10-1、10-2、10-3倍稀釋度的HCM

15、V病毒液用途： 測(cè)定感染性病毒量 單位: PFU (plaque forming unit)/ml 由一個(gè)感染性病毒顆粒增殖而形成的一個(gè)空斑稱(chēng)為空斑形成單位。 分純病毒蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaque assay） 用途：蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaque assay） 50%組織細(xì)胞感染量(50% tissue culture infectious dose, TCID50)概念: 測(cè)定病毒感染細(xì)胞后引起50%細(xì)胞病變或死亡的最小病毒量。方法:一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋?zhuān)謩e接種細(xì)胞，經(jīng)一定時(shí)間后觀察CPE、血細(xì)胞吸附等指標(biāo)，以能使50%細(xì)胞感染的病毒的最高稀釋度作為終點(diǎn)。最后用統(tǒng)計(jì)方

16、法計(jì)算出50%組織細(xì)胞感染量。用途: 測(cè)定感染性病毒的量和毒力50%組織細(xì)胞感染量(50% tissue culture 分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀釋度的HCMV感染的HEL細(xì)胞50%組織細(xì)胞感染量(TCID50) 分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、1香港大學(xué)專(zhuān)家：患者鼻咽標(biāo)本Vero細(xì)胞培養(yǎng)CPE EM觀察：冠狀病毒隨后加拿大和美國(guó)CDC等SARS國(guó)際協(xié)作組的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室也培養(yǎng)出了冠狀病毒利用免疫熒光法將分離病毒與SARS患者血清進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，反應(yīng)呈陽(yáng)性從冠狀病毒基因組的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法從培養(yǎng)上清中擴(kuò)增出了冠

17、狀病毒基因測(cè)序經(jīng)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性為64%左右SARS冠狀病毒的分離和鑒定香港大學(xué)專(zhuān)家：患者鼻咽標(biāo)本Vero細(xì)胞培養(yǎng)CPE EM加拿大專(zhuān)家完成了全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)與已知人和動(dòng)物的冠狀病毒的同源性差異較大確定為一種新的冠狀病毒。荷蘭的病毒學(xué)家：用這種冠狀病毒感染猴子出現(xiàn)了與SARS病人相同的臨床表現(xiàn)和病理特征再次從動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)引起SARS的病原體是這種冠狀病毒W(wǎng)HO將其命名為SARS冠狀病毒SARS冠狀病毒的分離和鑒定加拿大專(zhuān)家完成了全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)與已知人和動(dòng)物的冠狀病毒的電鏡免疫熒光 免疫印跡分子生物學(xué)技術(shù)核酸雜交PCR基因芯片病毒感染的快速診斷光鏡（包涵體）基因測(cè)序核酸電泳ELISA電鏡免疫熒光 免疫印跡分子生物學(xué)技術(shù)核酸雜交PCR基因芯片1. 名詞解釋: cytopathic e