1、酶動(dòng)力學(xué)及抑制劑Enzyme kinetics and Inhibitors 田維熙 教授中國(guó)科學(xué)院大學(xué)第一講 酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)主講教師：田維熙，中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院退休教授，博士生導(dǎo)師。中國(guó)科學(xué)院研究生院1978級(jí)研究生，師從鄒承魯院士，主攻酶學(xué)。 80年代曾在美國(guó)做訪問(wèn)學(xué)者及博士后研究。從事酶動(dòng)力學(xué)及脂肪酸合酶的作用機(jī)理、結(jié)構(gòu)與功能、抑制劑及其在減肥、抑癌中的應(yīng)用等方面的研究，和酶學(xué)教學(xué)工作。曾獲國(guó)家自然科學(xué)獎(jiǎng)，北京市科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)，中科院自然科學(xué)獎(jiǎng)，寶鋼優(yōu)秀教師獎(jiǎng)等獎(jiǎng)項(xiàng)。手機(jī)： Email: 助教：黃文元本課程的內(nèi)容和要求本課程內(nèi)容包括五講： 第一講，酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 第二講，酶的抑制作用

2、動(dòng)力學(xué) 第三講，pH影響的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和抑制作用動(dòng)力學(xué) 第四講，酶抑制劑和酶動(dòng)力學(xué)在生物醫(yī)藥研究中的應(yīng)用。 第五講，酶的功能基團(tuán)的定性和定量的實(shí)驗(yàn)判定。酶動(dòng)力學(xué)是在生物、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域的研究和開(kāi)發(fā)中仍在應(yīng)用的傳統(tǒng)理論和技術(shù)。搞清基本概念，理解基礎(chǔ)理論，掌握研究方法。教學(xué)參考資料R. A. Copeland. Enzymes, 2nd Ed. Wiley-VCH, Inc., 2000講義：田維熙 酶動(dòng)力學(xué)，酶的功能基團(tuán)及抑制劑，2011年修訂以上參考資料均通過(guò)課程網(wǎng)站提供電子版?？己耍?次課外練習(xí)30分，最遲在最后一次課結(jié)束時(shí)交；最后50分鐘課堂開(kāi)卷考試70分。一、酶動(dòng)力學(xué)研究什么？區(qū)

3、分kinetics （研究定量）和 dynamics（研究動(dòng)態(tài)）酶動(dòng)力學(xué)是對(duì)酶催化反應(yīng)速度和過(guò)程的定量研究。a 研究酶催化反應(yīng)速度和底物濃度的定量關(guān)系。b 研究外部因素，如環(huán)境pH值、抑制劑和激活劑等對(duì)催化反應(yīng)速度影響的定量規(guī)律；以及其定量規(guī)律和作用機(jī)制的關(guān)系。c 研究酶反應(yīng)中由底物到產(chǎn)物的作用機(jī)制歷程：由反應(yīng)速度的定量研究確定底物、產(chǎn)物加入和放出，以及復(fù)合物的形成、形式及轉(zhuǎn)換的過(guò)程。通過(guò)這些研究可以了解酶的作用機(jī)制，功能基團(tuán)，抑制劑等，并給出定量指標(biāo)和評(píng)價(jià)。二、化學(xué)動(dòng)力學(xué)的反應(yīng)級(jí)數(shù)0級(jí)到3級(jí)反應(yīng)的速度和作用物濃度的關(guān)系0-2級(jí)反應(yīng)的速度方程和產(chǎn)物方程酶反應(yīng)符合飽和動(dòng)力學(xué)Saturated K

4、inetics酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)是什么？酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)是底物首先要可逆結(jié)合在酶上特定部位，再發(fā)生催化反應(yīng)： E + S ES E + P這使反應(yīng)速度取決于ES濃度，而不是直接取決于底物濃度。原始酶濃度成為ES濃度上限，使得S濃度增加到一定程度后出現(xiàn)“飽和”現(xiàn)象。凡是先可逆結(jié)合，再不可逆變化的過(guò)程，都會(huì)表現(xiàn)出飽和動(dòng)力學(xué)的特征。飽和動(dòng)力學(xué)的時(shí)間過(guò)程和穩(wěn)態(tài)概念E + S ES E + P穩(wěn)態(tài)：在飽和動(dòng)力學(xué)中，ES濃度保持不變，從而反應(yīng)速度保持不變的一段狀態(tài)。（steady state）穩(wěn)態(tài)前是一段很短的時(shí)間過(guò)程，大多數(shù)酶反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)前不到1秒。達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)ES的生成速度和分解速度相等，ES濃度不變，反應(yīng)

5、速度不變。但穩(wěn)態(tài)不是平衡態(tài)，反應(yīng)物和產(chǎn)物的濃度都在變。酶活性測(cè)定的是穩(wěn)態(tài)時(shí)的反應(yīng)速度，也稱為酶反應(yīng)的初速度。一般酶動(dòng)力學(xué)研究是在測(cè)定酶反應(yīng)穩(wěn)態(tài)速度基礎(chǔ)上開(kāi)展的，是酶的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)。另有穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué):Transient kinetics三、米氏公式單底物單產(chǎn)物酶反應(yīng)推導(dǎo)要點(diǎn)1. 利用三點(diǎn)設(shè)定，由穩(wěn)態(tài)出發(fā)建立初步關(guān)系式。2. 利用總酶濃度為各個(gè)酶形式濃度之和代入初步關(guān)系式。3. 推導(dǎo)方向?yàn)閷?dǎo)出ES/ET表達(dá)式。該表達(dá)式即為v/Vm表達(dá)式。4. 適當(dāng)定義Km。這是推導(dǎo)酶動(dòng)力學(xué)速度方程時(shí)普遍適用的要點(diǎn)。動(dòng)力學(xué)參數(shù)微觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)：反應(yīng)過(guò)程中每一個(gè)具體步驟的正向和逆向速度常數(shù)。如本例中的k1, k-1。宏觀

6、動(dòng)力學(xué)參數(shù)：反映反應(yīng)總體情況的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。如本例中的Km, Vm。Vm ：最大反應(yīng)速度。表現(xiàn)催化步驟的快慢。 Vm = k2ET, k2又稱kcat，或轉(zhuǎn)換數(shù)。Km ：達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)所需的底物濃度。表現(xiàn)底物在酶上結(jié)合緊密程度的大小。米氏常數(shù) Km以v = Vm/2 代入米氏公式： Vm/2 = Vm S/(Km+S) Km+S = 2S，Km = SKm值越小，表示達(dá)到最大反應(yīng)速度一半（一半酶被底物結(jié)合）所需的底物濃度越低，即底物在酶上親和力越高。但Km不是解離常數(shù)。解離常數(shù)KS=k-1/k1 只有k2k-1時(shí)，近似地Km=KS。kcatVm的缺點(diǎn)：和酶濃度有關(guān)，不是本質(zhì)上的常數(shù)。 k

7、cat = Vm/ET，消除了酶濃度的影響。計(jì)算kcat時(shí)注意Vm和ET要摩爾化的單位。kcat是一級(jí)速度常數(shù)，單位為min-1或sec-1，即單位時(shí)間里1個(gè)酶分子能生成的產(chǎn)物數(shù)，即反應(yīng)次數(shù)，又稱為轉(zhuǎn)換數(shù)turnover number 。由于使用上的方便，目前Vm仍得到應(yīng)用。一般純理論研究中較多用kcat ，其它研究中較多用Vm 。kcat反映的過(guò)程包括 ES EP E+P，所以不是本質(zhì)上的微觀動(dòng)力學(xué)常數(shù)。kcat /KmKm和kcat分別體現(xiàn)了酶反應(yīng)結(jié)合步驟和催化步驟的動(dòng)力學(xué)特性。當(dāng)S Km時(shí)，米氏公式簡(jiǎn)化為： V = VmS / Km = (kcat / Km) ETSkcat / Km是

8、酶反應(yīng)的表觀二級(jí)速度常數(shù)，可以用來(lái)衡量酶的催化功能，用做比較酶的催化能力指標(biāo)。四、米氏公式的雙倒數(shù)作圖由米氏公式兩側(cè)同時(shí)取倒數(shù)，得到：以1/v vs. 1/S 作圖為直線。直線的斜率為Km/Vm，縱軸截距為1/Vm。由此作圖的斜率和縱軸截距即可算出Km和Vm。進(jìn)而可由Vm和酶濃度得到kcat 。Lineweaver-Burk Plots （雙倒數(shù)作圖）米氏方程還有多種作圖。較常見(jiàn)有Hanes-Wolff 作圖：在雙倒數(shù)的公式兩側(cè)同乘S，得到以下公式：以S/v vs. S 作圖為直線。還有Eadie-Hofstee作圖：雙倒數(shù)公式兩側(cè)同乘Vm，得到Vm/v = 1 + Km / S，再兩側(cè)同乘v

9、，移項(xiàng)得到：v = Vm - Km v/S以v vs. v/S 作圖為直線。但雙倒數(shù)作圖是最主要的、最常用的作圖。五、單底物酶反應(yīng)速度方程的一般形式如果不設(shè)定初速度，即需要考慮生成產(chǎn)物的逆反應(yīng)時(shí)，如下式： k1 k2 S + E ES E + P k-1 k-2 v = k2 ES - k-2 EP （1） 由穩(wěn)態(tài)： dES- = k1 ES + k-2 EP - k-1 ES - k2 ES dt = (k1S + k-2P) E - (k-1 + k2)ES = 0 （2） 將 ET = E + ES 代入（2）式： (k1S + k-2P) (ET - ES) - (k-1 + k2)E

10、S = 0 (k1S + k-2P)(ET ) = (k-1 + k2 + k1S + k-2P) ES (k1S + k-2P)ET ES = - （3） k-1 + k2 + k1S + k-2P ET = E + ES代入（2）式還可得： (k1S + k-2P)E = (k-1 + k2 ) (ET - E)整理得： (k-1 + k2 ) ETE = - （4） k-1 + k2 + k1S + k-2P（3），（4）式代入（1）式： (k1k2S + k2k-2P)ET - (k-1k-2P + k2k-2P) ET v = - k-1 + k2 +k1S + k-2P k1k2S

11、ET k-1k-2PET v = - （5） k-1 + k2 + k1S + k-2P （5）式為單底物酶反應(yīng)速度方程的一般形式。當(dāng)設(shè)定初速度，P = 0， （5）式簡(jiǎn)化為 k1k2 ETS VmS v = - = - （6） k-1 + k2 +k1S k-1 + k2 - + S k1即為米氏方程。 六、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作基于雙倒數(shù)作圖的實(shí)驗(yàn)是動(dòng)力學(xué)測(cè)定的基本方法。這是因?yàn)椋?1）利用數(shù)學(xué)方法的研究表明雙倒數(shù)作圖法是各種作圖法中計(jì)算參數(shù)準(zhǔn)確性最好的。 2）基于雙倒數(shù)作圖已導(dǎo)出了一系列動(dòng)力學(xué)作圖判斷的規(guī)則，并已廣泛應(yīng)用。至今酶動(dòng)力學(xué)基本實(shí)驗(yàn)測(cè)定絕大多數(shù)是基于雙倒數(shù)作圖來(lái)設(shè)計(jì)的。雙倒數(shù)作圖法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1）基本方法：選擇幾個(gè)不同底物濃度，分別測(cè)定酶反應(yīng)速度，以1/v對(duì)1/S作圖。2）底物濃度選擇：一般4-6個(gè)濃度，在Km上下，適當(dāng)偏選較大濃度。避免多數(shù)濃度處于一級(jí)區(qū)和0級(jí)區(qū)。（無(wú)底物抑制條件下）3）在技術(shù)上可行的條件下拉開(kāi)濃度間隔，且低濃度小間隔，高濃度大間隔。4）酶濃度適中。操作注意點(diǎn)1）關(guān)注實(shí)驗(yàn)條件：包括溫度、pH、緩沖液濃度、保護(hù)劑等。2）關(guān)注儀器條件及狀態(tài)：如恒溫狀態(tài)、波長(zhǎng)、比色杯選擇、光源。3）選擇好加樣工具：原則上大影響樣（如酶、低濃度底物）用精確工具，小影響樣用