1、PAGE PAGE - 10 -人參與蛤蚧配方顆粒配伍對(duì)腎陽(yáng)虛模型大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究周蓓朱巧鳳陳譽(yù)丹馮莉婷劉舒凌吳燕春關(guān)鍵詞人參;蛤蚧;配伍;腎陽(yáng)虛;下丘腦-垂體-腎上腺軸;下丘腦-垂體-甲狀腺軸;下丘腦-垂體-性腺軸;神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的根和根莖，性微溫，味甘、微苦，主歸脾、肺、心、腎經(jīng)，臨床常用于治療久病虛羸、驚悸失眠、陽(yáng)痿宮冷等1。因其具有強(qiáng)心、免疫增強(qiáng)、抗衰老、抗腫瘤等廣泛的藥理作用，故具有極高的藥用價(jià)值2。蛤蚧為壁虎科動(dòng)物蛤蚧GekkogeckoLinnaeus.的干燥體，性平而味咸，主歸肺、腎經(jīng)，臨床常用

2、于治療虛喘氣促、陽(yáng)痿、遺精等1。本草綱目曰：“昔人言補(bǔ)可去弱，人參、羊肉之屬。蛤蚧補(bǔ)肺氣，定喘止渴，功同人參;益陰血，助精扶羸，功同羊肉”。經(jīng)典人參蛤蚧補(bǔ)虛藥對(duì)配伍出自衛(wèi)生寶鑒“人參蛤蚧散”、醫(yī)級(jí)“人參蛤蚧丸”、圣濟(jì)總錄“獨(dú)圣餅”等，臨床應(yīng)用歷史悠久。古今諸多醫(yī)家認(rèn)為蛤蚧配伍人參使用可增強(qiáng)補(bǔ)虛壯陽(yáng)之效。目前的研究多集中在人參、蛤蚧為君藥的復(fù)方治療喘息性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等肺系疾病3-5。本課題組前期研究已明確蛤蚧對(duì)腫瘤、衰老等均具有實(shí)驗(yàn)免疫調(diào)節(jié)作用，并對(duì)腎陽(yáng)虛動(dòng)物具有改善作用6-8，但蛤蚧配伍人參后，是否能增強(qiáng)其補(bǔ)腎陽(yáng)作用及相關(guān)機(jī)制尚未明確。中藥配方顆粒由于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，更

3、有利于進(jìn)行配伍的藥效學(xué)研究。目前中藥配方顆粒的藥理作用研究主要集中在抗炎、止痛等中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)領(lǐng)域9。本研究通過(guò)氫化可的松復(fù)制腎陽(yáng)虛模型大鼠，觀察人參與蛤蚧配方顆粒配伍應(yīng)用對(duì)模型大鼠的補(bǔ)腎陽(yáng)作用，并探討其對(duì)模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal，HPA）軸、下丘腦-垂體-甲狀腺（hypothalamuspituitary-thyroid，HPT）軸、下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）軸及免疫功能形成的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)機(jī)制，為人參與蛤蚧配方顆粒的臨床配伍應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1材料1.1主要

4、儀器SQP型精密電子天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;InfiniteM200Pro型酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司;i2000型全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀購(gòu)自美國(guó)Abbott公司;cobasc311型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司;TGL-16型低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;GeneAmpPCRSystem9700型基因擴(kuò)增儀、ViiATM7型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)ABI公司;BX43型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯貿(mào)易（上海）有限公司。1.2主要藥物與試劑人參配方顆粒購(gòu)自江陰天江藥業(yè)有限公司（批號(hào)20220253，每2.50g顆粒相當(dāng)于

5、飲片10g）;蛤蚧配方顆粒購(gòu)自深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司（批號(hào)1903001C，每2.99g顆粒相當(dāng)于飲片20g）;金匱腎氣丸購(gòu)自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠（批號(hào)1803280，規(guī)格360丸）;氫化可的松注射液購(gòu)自百正藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)1908003，規(guī)格10mg2mL）;環(huán)磷酸腺苷（serumcyclicadenosinemonophosphate，cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（guanosinecyclicphosphate，cGMP）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropinreleasinghormone，CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotr

6、opichormone，ACTH）、皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）、睪酮（testosterone，T）的大鼠酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）試劑盒均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（批號(hào)分別為L(zhǎng)Y2B9CTRRR、6P6TK8JK57、N3VIFVDNRX、3H9J32UP81、512AVRZZQT、9DVDF6-2B98）;三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxine，T4）、雌二醇（estradiol，E2）的放射免疫分析試劑盒均購(gòu)自意大利DiaSorin公司（批號(hào)分別為2

7、02246、202213B、RE34872）;鼠源IgG、IgM試劑盒均購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司（批號(hào)分別為38451501、35257501）;Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司（批號(hào)15596026）;蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)G1120）;GoldView染料購(gòu)自上海賽百勝基因技術(shù)有限公司（批號(hào)HGV-）;RNA酶抑制劑、SuperScriptTM反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Epicentre公司（批號(hào)分別為SRI6310K、RF910100）;2PCRMasterMix核酸擴(kuò)增試劑購(gòu)自美國(guó)Arraystar公司（批號(hào)AS-MR-006-25）。1.

8、3動(dòng)物48只雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（20020）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2022-0002。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)（批準(zhǔn)號(hào)DW20220226-003）。2方法2.1分組、造模與給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，根據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、金匱腎氣丸組（陽(yáng)性對(duì)照）、人參組、蛤蚧組、配伍組，每組8只。除正常組外，其余組大鼠每天后腿肌內(nèi)注射氫化可的松25mg/kg，連續(xù)15d進(jìn)行造模，根據(jù)參考文獻(xiàn)10判斷造模是否成功;正常組同期肌內(nèi)注射等體積生理鹽水。造模成功后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行灌胃。金匱腎氣丸組灌胃劑量為2.33g/kg，臨

9、用時(shí)用生理鹽水配制。人參、蛤蚧按照配方顆粒量/飲片量比例、人體質(zhì)量60kg換算，并參照人與大鼠體表面積折算的等效劑量比值換算11，臨用時(shí)用生理鹽水溶解，37水浴攪拌5min，配制混懸液。人參組灌胃劑量為0.53g/kg（臨床等效劑量的2倍），蛤蚧組灌胃劑量為0.21g/kg（臨床等效劑量的2倍），配伍組灌胃劑量為人參配方顆粒0.53g/kg和蛤蚧配方顆粒0.21g/kg。模型組和正常組灌胃等體積生理鹽水。所有大鼠灌胃體積均為10mL/kg，每日1次，共灌胃28d。2.2大鼠體質(zhì)量、肛溫測(cè)定分別于灌胃前和灌胃第7、14、21、28天，采用電子天平測(cè)定大鼠體質(zhì)量，采用電子體溫計(jì)測(cè)定大鼠肛溫。2.3

10、取材與處理灌胃28d后，大鼠禁食不禁水12h，然后以水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血。血樣以3000r/min于4離心10min，取上清液于-80保存。腹主動(dòng)脈取血后，在冰上將大鼠左右腎上腺、甲狀腺、左右睪丸完整剪下，生理鹽水洗凈，置于4%甲醛溶液中固定。在冰下摘取大鼠下丘腦，置于凍存管在-80保存待測(cè)。2.4大鼠血清cAMP、cGMP水平檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)。根據(jù)“2.1”項(xiàng)下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下取材與處理。按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)大鼠血清cAMP、cGMP水平并計(jì)算cAMP/cGMP。2.5大鼠HPA軸（CRH、ACTH、CORT）、HPT軸（T3、T4）、HPG軸（T、E

11、2）、免疫（IgG、IgM）相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)根據(jù)“2.1”項(xiàng)下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下取材與處理。采用ELISA法，按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)大鼠血清CRH、ACTH、CORT、T水平。采用放射免疫法，按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)T3、T4、E2水平。采用免疫比濁法，按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)IgG、IgM水平。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算T/E2。2.6大鼠腎上腺、甲狀腺、睪丸組織病理形態(tài)學(xué)觀察根據(jù)“2.1”項(xiàng)下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下取材與處理。腎上腺、甲狀腺、睪丸組織用4%甲醛溶液固定，再進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、乙醇梯度脫蠟、HE染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化

12、并拍照。2.7大鼠下丘腦CRH、TRH、GnRHmRNA表達(dá)水平檢測(cè)采用qRT-PCR法檢測(cè)。根據(jù)“2.1”項(xiàng)下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下取材與處理。取-80凍存的下丘腦（每組取3只小鼠樣本），先用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后行PCR擴(kuò)增，用以檢測(cè)CRH、促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropinreleasinghormone，TRH）、促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasinghormone，GnRh）mRNA表達(dá)水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

13、。計(jì)量資料以xs表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。3結(jié)果3.1人參與蛤蚧配方顆粒配伍對(duì)腎陽(yáng)虛模型大鼠體質(zhì)量、肛溫的影響與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量在不同時(shí)點(diǎn)均顯著降低（P0.01）。各給藥組大鼠灌胃前體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）;灌胃第7、14、21、28天，各給藥組大鼠體質(zhì)量均有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。與配伍組比較，人參組、蛤蚧組大鼠體質(zhì)量在不同時(shí)點(diǎn)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)果見表2。與正常組比較，模型組大鼠肛溫在各時(shí)點(diǎn)均顯著下降（P0.05或P0.01）。各給藥組大鼠灌胃前肛溫差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

14、（P0.05）。與模型組比較，配伍組大鼠肛溫在灌胃第7、14、21、28天均顯著升高（P0.05或P0.01）。與配伍組比較，人參組、蛤蚧組大鼠肛溫在灌胃第7天均顯著降低（P0.05），蛤蚧組大鼠肛溫在灌胃第14、21天均顯著降低（P0.05）。這說(shuō)明人參與蛤蚧配方顆粒配伍對(duì)升高腎陽(yáng)虛模型大鼠肛溫具有一定的協(xié)同作用。結(jié)果見表3。3.2人參與蛤蚧配方顆粒配伍對(duì)腎陽(yáng)虛模型大鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP的影響與正常組比較，模型組大鼠cAMP水平、cAMP/cGMP顯著降低（P0.01），cGMP水平顯著升高（P0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠cAMP水平、cAMP/cGMP顯著

15、升高（P0.05或P0.01），cGMP水平顯著降低（P0.01）。與配伍組比較，人參組、蛤蚧組大鼠cAMP水平、cAMP/cGMP有降低趨勢(shì)，cGMP水平有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)果見表4。3.3人參與蛤蚧配方顆粒配伍對(duì)腎陽(yáng)虛模型大鼠HPA軸、HPT軸、HPG軸、免疫相關(guān)指標(biāo)的影響與正常組比較，模型組大鼠CRH、ACTH、CORT、T3、T4、T水平和T/E2均顯著降低，E2、IgG、IgG水平均顯著升高（P0.05或P0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠CRH、ACTH、CORT、T3水平均顯著升高（P0.05或P0.01），金匱腎氣丸組、配伍組大鼠T水平、T/E2

16、均顯著升高（P0.05或P0.01），人參組、配伍組大鼠E2水平均顯著降低（P0.05），配伍組大鼠IgG水平顯著降低（P0.05）。與配伍組比較，人參組、蛤蚧組大鼠CRH、ACTH、CORT、T3、T4水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），金匱腎氣丸組T4水平顯著升高（P0.01），人參組、蛤蚧組大鼠T/E2顯著降低（P0.05或P0.01）。這說(shuō)明人參與蛤蚧配方顆粒配伍對(duì)升高腎陽(yáng)虛大鼠T/E2比值有一定協(xié)同作用。結(jié)果見表5。3.4人參與蛤蚧配方顆粒配伍對(duì)腎陽(yáng)虛模型大鼠腎上腺、甲狀腺、睪丸組織病理形態(tài)學(xué)的影響與正常組比較，模型組大鼠可見腎上腺組織皮質(zhì)細(xì)胞分層不清晰，細(xì)胞排列不規(guī)則、體積縮小，束

17、狀帶變窄，細(xì)胞呈空泡樣改變;甲狀腺組織濾泡大部分上皮細(xì)胞被破壞，細(xì)胞核減少，組織紊亂，部分濾泡膠質(zhì)缺失，可見明顯病理性損傷;睪丸組織生精小管排列略松散、間隙略變大，部分生精細(xì)胞排列紊亂，部分有初級(jí)精母細(xì)胞固縮、精子細(xì)胞質(zhì)消失現(xiàn)象，有輕微病理性損傷。與模型組比較，各給藥組大鼠腎上腺、甲狀腺、睪丸組織的病理性損傷均有所改善。結(jié)果見圖1。3.5人參與蛤蚧配方顆粒配伍對(duì)腎陽(yáng)虛模型大鼠下丘腦CRH、TRH、GnRHmRNA表達(dá)的影響與正常組比較，模型組大鼠下丘腦CRHmRNA表達(dá)水平顯著升高，TRH、GnRHmRNA表達(dá)水平均顯著降低（P0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠下丘腦CRHmRNA表達(dá)水平

18、均顯著降低，TRH、GnRHmRNA表達(dá)水平均顯著升高（P0.01）。與配伍組比較，金匱腎氣丸組CRH、GnRH和蛤蚧組CRHmRNA表達(dá)水平均顯著升高（P0.01）。這說(shuō)明人參與蛤蚧配方顆粒配伍對(duì)降低腎陽(yáng)虛模型大鼠下丘腦CRHmRNA表達(dá)有一定的協(xié)同作用。結(jié)果見圖2。4討論腎陽(yáng)虛是中醫(yī)研究的熱點(diǎn)。沈自尹院士多年研究得出腎陽(yáng)虛證具有下丘腦-垂體-靶腺軸（包括HPA軸、HPT軸、HPG軸）不同水平、不同程度的功能紊亂，也與免疫功能形成的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)相關(guān)12。神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)將神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫三大系統(tǒng)相互間的調(diào)節(jié)關(guān)系作為動(dòng)態(tài)性整體進(jìn)行全面系統(tǒng)研究，并以細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)作為信息

19、分子來(lái)實(shí)現(xiàn)人體整體功能的調(diào)控13。中醫(yī)認(rèn)為腎是先天之本，腎陽(yáng)乃一身陽(yáng)氣之根本。腎陽(yáng)虛是中醫(yī)臨床基本證型之一。腎陽(yáng)虛證有畏寒肢冷、腰膝酸痛、男子遺精、女子帶下清稀等臨床癥狀。外源性糖皮質(zhì)激素復(fù)制大鼠腎陽(yáng)虛模型是目前比較經(jīng)典、應(yīng)用最廣的模型。本研究造模后大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量、肛溫下降。研究表明，腎陽(yáng)虛的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括cAMP、cGMP水平及cAMP/cGMP10。本研究中模型組大鼠cAMP水平、cAMP/cGMP顯著降低，cGMP水平顯著升高，表明腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型構(gòu)建成功。本研究復(fù)制大鼠腎陽(yáng)虛模型是利用外源性糖皮質(zhì)激素抑制ACTH的釋放，使腎上腺萎縮、腎上腺皮質(zhì)分泌類固醇激素減少，能真實(shí)模擬HPA軸受抑制時(shí)

20、的病理狀態(tài)，而HPT軸、HPG軸受干擾相對(duì)不明顯12。血清CRH、ACTH、糖皮質(zhì)激素（主要為CORT）為HPA軸參與控制應(yīng)激反應(yīng)的激素。同時(shí)，糖皮質(zhì)激素升高也會(huì)造成HPA軸負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，下丘腦CRHmRNA表達(dá)水平升高14。本研究結(jié)果顯示，造模后大鼠HPA軸功能被抑制，表現(xiàn)為血清CORT、CRH、ACTH水平降低，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致15-16;人參與蛤蚧配方顆粒配伍灌胃能顯著升高大鼠血清CRH、ACTH、CORT水平，而顯著降低下丘腦CRHmRNA表達(dá)水平，且對(duì)下丘腦CRHmRNA表達(dá)的影響效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥金匱腎氣丸，同時(shí)改善腎上腺組織的病理?yè)p傷。這提示人參與蛤蚧配方顆粒配伍能有效改善HPA軸功能紊亂及病理?yè)p傷。HPT軸功能抑制與T3、T4分泌紊亂有關(guān)，T3是診斷甲狀腺功能亢進(jìn)癥的特異性指標(biāo)，T4是甲狀腺分泌最豐富的激素，而臨床上腎陽(yáng)虛者通常表現(xiàn)為甲狀腺功能降低17。本研究結(jié)果顯示，外源性糖皮質(zhì)激素復(fù)制腎陽(yáng)虛模型大鼠的T3、T4水平和下丘腦TRHmRNA表達(dá)水平顯著降低，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致18-20;人參與蛤蚧配方顆粒配伍灌胃后，大鼠T3水平顯著升高，T4水平有升高趨勢(shì)，而陽(yáng)性對(duì)照藥金匱腎氣丸對(duì)T4水