1、抗原與抗體反應(yīng)免疫檢測實(shí)驗(yàn)原理和方法第1頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三一、凝集反應(yīng) 凝集反應(yīng)是指顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)的可見性現(xiàn)象。顆?？乖缤暾募?xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。凝集反應(yīng)中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。第2頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三二、沉淀反應(yīng) 當(dāng)抗原是可溶性分子時，與抗體結(jié)合則形成沉淀。1、絮狀沉淀反應(yīng) 一系列試管中加入等量的抗體和遞增量的抗原，在中性條件下37度保溫1-2h，便可見到絮狀的蛋白質(zhì)沉淀。可用于尋找抗原抗體反應(yīng)的合適比例，檢測抗原抗體的分子比。2、環(huán)狀沉淀反應(yīng) 在試管中

2、加入抗體后，小心加入相應(yīng)抗原，使抗原抗體步混合，37度保溫10-20min，在二者界面上出現(xiàn)環(huán)狀沉淀。不能用于定量測定。第3頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三3、雙向擴(kuò)散：又稱瓊脂擴(kuò)散，是利用瓊脂凝膠作介質(zhì)的一種沉淀反應(yīng)。 瓊脂是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使大分子物質(zhì)通過，分子的擴(kuò)散作用使分別兩處的抗原抗體相遇，比例合適時形成沉淀?？捎^測到沉淀弧。 沉淀弧的特征與位置取決于抗原分子的大小、結(jié)構(gòu)、擴(kuò)散系數(shù)和濃度等。當(dāng)抗原、抗體存在多種體系時，會出現(xiàn)多條沉淀弧。第4頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三雙向擴(kuò)散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在

3、顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。第5頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三 抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同： 抗原抗體為多體系時，出現(xiàn)的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。第6頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三4、單向免疫擴(kuò)散：又稱單向瓊脂擴(kuò)散，是定量抗原的一種檢測方法。與雙向擴(kuò)散不同的是在瓊脂中含有一定量的抗體，孔內(nèi)加入未知量的相應(yīng)抗原。在37度保溫過程中，孔內(nèi)的抗原向周圍擴(kuò)散，與抗體形成沉淀圈。根據(jù)沉淀圈的大小確定抗原的含量

4、第7頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三 另外還有其他眾多的免疫檢測技術(shù)和手段，其機(jī)理都利用了抗原抗體的沉淀反應(yīng)。例如微量免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳等。只不過其檢測的對象和檢測的目的各有不同。第8頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 當(dāng)抗體與細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆?？乖Y(jié)合并形成抗原抗體復(fù)合物后，可結(jié)合補(bǔ)體引起溶菌、溶血效應(yīng)。用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)既可以測知患者血清中補(bǔ)體的總量，也可以檢測未知抗原或抗體的量。 測定人血清補(bǔ)體總量的方法是以綿羊紅血球的溶血為指示。當(dāng)綿羊紅血球與抗綿羊紅血球結(jié)合后，加患者血清，觀測溶血程度。第9頁，共17頁，20

5、22年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三 用于測定未知抗原/抗體時，采用兩套系統(tǒng)，一套是待測的抗原抗體系統(tǒng)，稱為檢測系統(tǒng)，一套是包括綿羊紅血球和抗綿羊紅血球抗體的指示系統(tǒng)。待測系統(tǒng)中有無待測得抗原/抗體是利用指示系統(tǒng)中是否出現(xiàn)溶血來判斷。 反應(yīng)的過程是首先加待測得抗原/抗體，反應(yīng)一段時間后加入補(bǔ)體，在反應(yīng)一段時間后加指示系統(tǒng)。有待測抗原抗體結(jié)合時，必然結(jié)合補(bǔ)體，不會出現(xiàn)溶血，沒有待測物質(zhì)時出現(xiàn)溶血。第10頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三第11頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三四、熒光抗體技術(shù) 免疫熒光法是將熒光素與特異性血清抗體以化學(xué)方式結(jié)合起

6、來，然后將此熒光標(biāo)記了的抗體作為一種試劑在特定條件下浸染標(biāo)本，使與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)，再在熒光顯微鏡下，以紫外光為光源進(jìn)行觀察。當(dāng)出現(xiàn)熒光時，表明標(biāo)記抗體存在，相應(yīng)的抗原也存在。 免疫熒光法有直接法和間接法兩種。第12頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三第13頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三第四節(jié) 免疫親和層析 生物高分子具有能和某種相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，例如酶的活性中心或別構(gòu)中心能和專一的底物、抑制劑、輔助因子效應(yīng)劑通過某些次級鍵相結(jié)合，并在一定條件下又可以解離。抗體與抗原，激素及其受體，核糖核酸與其互補(bǔ)的脫氧核糖核酸等體系

7、，都具有類似的特性。這種高分子和配基之間形成專一的可解離的復(fù)合物的能力稱為親和力。根據(jù)這種具有親和力的生物分子間可逆的結(jié)合和解離的原理發(fā)展起來的層析就稱為親和層析。第14頁，共17頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)30分，星期三親和層析法的基本過程：1、偶聯(lián)：將欲分離的高分子物質(zhì)的配基在不影響其生物功能的情況下與水不相溶性的載體結(jié)合，制成親和吸附劑或免疫吸附劑。2、裝柱：在層析柱內(nèi)裝入固相化的配基3、親和層析：含有高分子物質(zhì)的混合液在有利于配基和高分子之間形成復(fù)合物的條件下進(jìn)入裝有親和吸附劑的層析柱。高分子物質(zhì)結(jié)合留在柱內(nèi)，其他雜質(zhì)流出。4、洗脫：改變條件，促使配基和高分子物質(zhì)分離而釋放出需要的物質(zhì)。5、再生：將親和層析柱的充分洗滌