1、生命活動(dòng)中的一系列重要過程如細(xì)胞增殖、分化等是通過基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，這種基因表達(dá)操縱首先通過特定轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行。核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor)是一類蛋白質(zhì)，它們具有和某些基因上啟動(dòng)子(promotor)區(qū)的固定核苷酸序列結(jié)合，而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的功能。核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-B)是其中重要的一組蛋白質(zhì)，也是一類重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，廣泛存在于各種真核細(xì)胞中【1】。1986年，Sen 等【2】首次從鼠B淋巴細(xì)胞核提取物中，發(fā)覺一種能與免疫球蛋白K輕鏈基因增強(qiáng)子KB序列(GGGACTTTCC)特異結(jié)合，調(diào)節(jié)其基因表達(dá)的核蛋白因子，稱之為NF-B。

2、它們能夠調(diào)節(jié)許多與免疫功能和炎癥有關(guān)的基因，在機(jī)體生理和病理?xiàng)l件下，發(fā)揮重要的功能。現(xiàn)已表明NF-B的功能涉及到免疫反應(yīng)、胸腺發(fā)育、胚胎發(fā)生、炎癥和急性反應(yīng)、細(xì)胞生殖、細(xì)胞凋亡、病毒感染等多種病理過程。1. NF-KB的概述1.1 NF-KB/Rel蛋白家族及結(jié)構(gòu)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共有五種NF-B家族成員【3】，它們是原癌基因CRel、NFB1(p50p105)、NFB2(p52p100)、Re1A(p65)、RelB。這些蛋白都有一個(gè)大約由300個(gè)氨基酸組成的氨基末端，稱為Rel同源區(qū)(Rel homogeneous domain，RHD)或NRD(NFBReldorsa1)。其RHD內(nèi)含DN

3、A結(jié)合區(qū)，二聚體化區(qū)和核定位序列，分不具有與DNA -B序列結(jié)合、與同源或異源亞基二聚體化以及與NF-B抑制蛋白（IKB）家族成員相互作用并攜帶核定位信號(hào)（NLS），參與活化的NF-B由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的迅速移動(dòng)等功能。依照結(jié)構(gòu)、功能和合成方式的不同，Rel蛋白分為兩類。一類為P50(NF-KB1）和P52(NF-KB2），分不由含有C-末端錨蛋白重復(fù)序列（ahkrin repeat motif）的前體蛋白p105和p100通過ATP依靠蛋白水解過程裂解而形成。該類蛋白含有RHD，但缺乏轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，無獨(dú)立激活基因轉(zhuǎn)錄的功能。另一類為p65(RelA)，Rel（c-Rel),Rel B和果蠅的do

4、rsal、Dif和Relish,它們沒有前體，除N端的RHD外，其C-端有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，具有直接作用轉(zhuǎn)錄設(shè)備而激活基因轉(zhuǎn)錄的功能。除RelB外，其他成員在體外都可形成同二聚體或異二聚體，RelB只能形成由p50或p52組成的二聚體。1.2 NF-B的抑制蛋白IB和IKK在沒有刺激的細(xì)胞中，大部分的NF-B二聚體通過與細(xì)胞質(zhì)中三個(gè)抑制因子（IB、IB、IB）中的一個(gè)結(jié)合而以無活性的狀態(tài)存在【4】。目前研究發(fā)覺IKBs共有7種結(jié)構(gòu)類型，在哺乳動(dòng)物中最重要的IBs是IB、IB、IB，且只有這3種IB含有在外界信號(hào)刺激下被降解的N-末端調(diào)控區(qū)域【5】。它們共同的結(jié)構(gòu)特征是在c端有一個(gè)特征性的錨

5、蛋白重復(fù)序列。IB阻礙并屏蔽位于RHD末端的核定位信號(hào)，研究證明，盡管不同的外界刺激通過作用于不同的IB引起NF-B有差不地活化【6】，但幾乎所有已知NF-B誘導(dǎo)物均能通過IB的降解迅速而短暫地活化NF-kB，同時(shí)IB不僅阻止已轉(zhuǎn)移激活二聚體的DNA結(jié)合，而且裂解他們同源DNA位點(diǎn)前體復(fù)合物。IB和IB則起到緩沖系統(tǒng)活化波動(dòng)趨勢(shì)的作用，從而保持NF-B有一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)刻的響應(yīng)。【5】I-B激酶IKK是I-B離開NF-B并使之得以活化的必需前提，隨之降解抑制因子I-B。IKK是由一個(gè)調(diào)節(jié)亞單位，IKK-(也被稱為NEMO)和兩個(gè)催化亞單位IKK-，IKK組成。IKK和IKK屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶

6、，而NEMO雖包含有多個(gè)蛋白反應(yīng)基序但卻無明顯的催化區(qū)。在經(jīng)典的NF-KB激活途徑中，IKK的活化起到了特不重要的作用。IKK基因敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)小鼠在缺乏IKK情況下，不僅阻礙NF-B激活通路，而且由于不能操縱大量肝細(xì)胞凋亡而在胚胎期出現(xiàn)死亡，這些小鼠在炎癥細(xì)胞因子作用時(shí)，NF-B激活通路出現(xiàn)障礙，由此講明，IKK是促炎癥反應(yīng)因子刺激誘導(dǎo)NF-B活化的要緊激酶，IKK在NF-B激活通路中可能比IKK更重要【7】。IKK不只是傳統(tǒng)的認(rèn)為只是I-B激酶，而且以其他的方式阻礙著基因的表達(dá)。DEVIN和YAMAM0TO等【8-9】研究認(rèn)為IKK可作用于IKK及其上游區(qū)而直接或問接增加IKK對(duì)IKB的磷酸

7、化作用，從而阻礙NF-KB基因的激活表達(dá)。Sankar ghosh和matthew s.hayden發(fā)覺IKK限制了促炎癥巨噬細(xì)胞的反應(yīng)【10】。2NF-B的激活細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-B-IBs復(fù)合物(NF-B-IB、NF-B-IB)在胞漿與胞核之間穿梭，處于動(dòng)態(tài)平衡。各種信號(hào)通過降解IBs的方式來活化NF-B，活化的NF-B然后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合。IBs首先是在IBs激酶（IKK）催化下使其的32和36位絲氨酸殘基磷酸化。接著IBs在SCF-E3泛素化酶復(fù)合體的催化作用下多泛素化而被蛋白酶降解。活化的NF-B轉(zhuǎn)位到核內(nèi)與其相關(guān)的DNA基序結(jié)合以誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。這種方式的NF-B活

8、化途徑被稱為經(jīng)典的NF-B活化途徑。NF-B通過該途徑調(diào)節(jié)的目的基因有炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子(如TNF-、IL-1等)、黏附分子、急性期蛋白及可誘導(dǎo)的效應(yīng)期酶等。其他的不被人所熟知的途徑也能從IBs中活化部分的NF-B。這些途徑包括酪氨酸磷酸化誘導(dǎo)的IBs解離途徑途徑和蛋白激酶-2誘導(dǎo)的IBs的流淌加快的方式。釋放后的NF-kB能夠通過例如修飾自身的亞單位的方式來阻礙自身的轉(zhuǎn)錄激活效能。活化的NF-B快速的誘導(dǎo)編碼IB的基因的轉(zhuǎn)錄，因此產(chǎn)生高水平的自身抑制劑。新合成的自由的IB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，然后使DNA上NF-B解離同時(shí)將NF-B排出細(xì)胞核，因而恢復(fù)到靜息狀態(tài)。3.生物學(xué)功能3.1 NF- B與細(xì)

9、胞凋亡3.1.1抗凋亡的作用最初，Beg等【11】在1995年發(fā)覺缺乏RelA亞單位的鼠在胚胎期的死亡要緊是因?yàn)楦渭?xì)胞大量凋亡引起的提示含有RelA的NF-B二聚體在胚肝中能夠愛護(hù)細(xì)胞不受促凋亡基因的阻礙：實(shí)驗(yàn)表明，缺乏NF-BRel基因或含有NF-BRel抑制劑的培養(yǎng)細(xì)胞在受到TNF或T細(xì)胞激活劑刺激時(shí)易發(fā)生凋亡【12】。在B淋巴細(xì)胞系中也可發(fā)覺NF-B的抗凋亡作用。這些細(xì)胞系表達(dá)一定活性NF-B，若被滅活則可誘導(dǎo)凋亡。當(dāng)成熟B淋巴細(xì)胞被NF-B活性抑制劑或抗氧化劑處理時(shí)，就發(fā)生了細(xì)胞凋亡。因此B細(xì)胞中一定水平的NF-B關(guān)于保證細(xì)胞存活及增殖有重要的作用【13】。目前，NF-B要緊通過以下三

10、條途徑來抑制凋亡【14】。(1)NF-B通過上調(diào)編碼抗凋亡的細(xì)胞因子的基因表達(dá)來抑制凋亡。ML等【15】發(fā)覺在白細(xì)胞介素一6(IL一6)的啟動(dòng)子上有NF-B的結(jié)合位點(diǎn)，TNF-，輻射等通過激活NF-B而上調(diào)IL-6的基因表達(dá)。同樣的，研究者們也發(fā)覺在IL-1，IL-2，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)等細(xì)胞因子上游啟動(dòng)子序列中均含有NF-B的結(jié)合位點(diǎn)【16】。(2)NF-B通過誘導(dǎo)或上調(diào)抗凋亡基因抑制凋亡。公認(rèn)的抗凋亡蛋白Bclxl是Bcl一2家族中belX基因的表達(dá)產(chǎn)物。Herramnn等【17】發(fā)覺在該基因的啟動(dòng)子中也含有2個(gè)與NF-B優(yōu)先結(jié)合的序列。Wang等發(fā)覺NF-B能夠通過激活bc

11、l-2家族中的A1Bfl一1而抑制了由TNF引起的凋亡。(3)NF-B通過誘導(dǎo)TRAF(TNF受體相關(guān)因子)和IAP(凋亡抑制蛋白)抑制凋亡【18】。TRAF與其相應(yīng)的配體TNF結(jié)合后，在誘發(fā)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，激活細(xì)胞內(nèi)NF-B。NF-B抗凋亡機(jī)制是作用于Caspase-8和線粒體的上游，進(jìn)一步研究表明，NF-B在基因和蛋白表達(dá)兩個(gè)水平上操縱了TRAF一1、TRAF一2、cIAP1、cIAP2的表達(dá)，從而抑制了Caspase-8的活性。而Caspase-8是接到死亡受體相關(guān)信號(hào)必須的凋亡蛋白酶，它的活化是TNF誘發(fā)細(xì)胞凋亡途徑中關(guān)鍵的一環(huán)。此途徑也是NF-B抗細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。3.1.2促凋亡

12、的作用然而，在另外一些實(shí)驗(yàn)研究中人們看到了與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反的數(shù)據(jù)。例如，Trede等【19】用鬼臼亞乙苷作用于人T細(xì)胞和早幼粒白血病細(xì)胞，可活化NFKB并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的毒性伴隨著NF-B 的誘導(dǎo)，NF-B的激活引起了細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)顯示，辛德畢斯(Sindbis)病轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在細(xì)胞凋亡的起始時(shí)期甚至需要NF-B的參與【20】。滕偉禹等人證明Toll樣受體4介導(dǎo)的NF-B信號(hào)途徑參與了腦內(nèi)出血的致病機(jī)制，且證明腦內(nèi)出血后存在細(xì)胞凋亡，可能與NF-B的激活有關(guān)【21】。3.2對(duì)炎癥作用炎癥是機(jī)體抵御病原體入侵的一種機(jī)制。它是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，包括一些細(xì)胞因子的合成與釋放

13、。NF-B 參與炎癥反應(yīng)。NF-B能夠高效誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子(TNF-、IL-1、IL-6等)、趨化因子、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)、炎性酶(iNOS、COX-2)等的基因表達(dá)，對(duì)炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大，在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化。因此NF-B是許多炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著要緊作用。4. 檢測(cè)方法4.1蛋白印跡(Western blot)能夠從兩個(gè)方面應(yīng)用Western blot進(jìn)行檢測(cè)，一是NF-B的表達(dá)量，生理?xiàng)l件下NF-B存在一定量表達(dá)，疾病及各種外源刺激下NF-B表達(dá)量發(fā)生異常改變；二是能夠檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中IB的降解，細(xì)胞未受到任何刺激時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的NF-B處于

14、未活化狀態(tài)，NF-BI-B復(fù)合物以無活性方式將NF-B滯留于胞漿，當(dāng)細(xì)胞受到外界因素刺激時(shí)，NF-B與IB分離，NF-B進(jìn)入細(xì)胞核，IB則被降解。Western blot能夠反映NF-B蛋白表達(dá)量的變化情況，從而可作為研究其功能的一種手段。Western blot檢測(cè)NF-B簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，不需要專門儀器，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，是目前檢測(cè)NF-B常用的一種方法。不足之處是不能直接反映NF-B活性，而且部分轉(zhuǎn)錄因子功能改變時(shí)，只是由于活性變化所引起，蛋白總量并不發(fā)生改變，Western blot不能反映出這種由于活性改變引起的NF-B功能變化，其特異性也有待進(jìn)一步提高【22】。4.2 凝膠遷移滯留實(shí)驗(yàn)(e

15、lectrophoretic mobility shift assay，EMSA)EMSA是目前用于檢測(cè)NF-B的DNA結(jié)合活性應(yīng)用最多的方法，已成為檢測(cè)NF-B結(jié)合活性的經(jīng)典方法【23】。EMSA原理：帶標(biāo)記的與NF-B有共有序列的寡聚核苷酸探針結(jié)合到NF-B后，因其分子量和表面電荷發(fā)生改變，在非變性條件下行凝膠電泳，其泳動(dòng)率比未結(jié)合的游離探針慢，經(jīng)自顯影后即可檢測(cè)TF活性。結(jié)合凝膠圖像分析系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。EMSA依照所用標(biāo)記物的不同分放射性和非放射性兩種。放射性EMSA 敏感性高，而且特異性強(qiáng)。非放射性EMSA勿需通過放射顯影，采納生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光原理進(jìn)行檢測(cè)，敏感度與放射性EMS

16、A相近。EMSA已廣泛應(yīng)用于NF-B活性檢測(cè)，但其本身也存在一定缺點(diǎn)，如關(guān)于低親和力結(jié)合專門難進(jìn)行鑒定，難以比較不同片段之間親和力大小的差異；關(guān)于蛋白復(fù)合體與DNA的結(jié)合也無法鑒定等。由于體內(nèi)外環(huán)境存在巨大差異，EMSA 目前專門難真正重建體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA之間結(jié)合過程【22】。4.3 ELISA為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法這是一種以ELISA為基礎(chǔ)的試劑盒來檢測(cè)并定量轉(zhuǎn)錄因子的活動(dòng)的檢測(cè)方法。試劑盒內(nèi)有一個(gè)96孔板，含有NFkB固有序列結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸差不多被固定在板上。包含在細(xì)胞核或全細(xì)胞提取物中的的激活的NFkB同源二聚體和異源二聚體特異的結(jié)合在寡核苷酸上。通過使用直接與轉(zhuǎn)錄因子p65，p50，p

17、52，c-Rel或者Rel B亞基配對(duì)的抗體，活化的轉(zhuǎn)錄因子亞基結(jié)合到寡核苷酸而被檢測(cè)到。第二抗體與辣根過氧化物酶共軛結(jié)合后提供了敏感的顯色反應(yīng)，這能夠方便的用分光光度法定量測(cè)定。此試劑盒是一個(gè)快速，使用方便且敏感特異的試驗(yàn)方法。4.4報(bào)告基因分析系統(tǒng)檢測(cè)另一種檢測(cè)NF-B活性的方法是以報(bào)告基因?yàn)榛A(chǔ)的檢測(cè)方法，如熒光素酶或一半乳糖苷酶等。報(bào)告基因分析系統(tǒng)(reporter gene assay)的建立，給NF-B的轉(zhuǎn)錄活性評(píng)價(jià)帶來了極大方便。(1) 一半乳糖苷酶(-galatosidase，-ga1)報(bào)告基因：大腸桿菌編碼的-gal能夠水解乳糖生成半乳糖，分光光度計(jì)檢測(cè)顏色改變可反映轉(zhuǎn)錄活性

18、。-gal基因現(xiàn)常用作轉(zhuǎn)染的參照體系。(2)熒光素(1uciferase，luc)報(bào)告基因：luc能催化甲蟲的熒光素產(chǎn)生氧化性羧化作用，發(fā)射出光子，能被光度計(jì)或閃耀計(jì)數(shù)器捕獲定量。luc分析具有快速、方便，具有專門好的濃度線性范圍(具有78個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍)，而被廣泛應(yīng)用【24】。(4)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)報(bào)告基因：GFP在紫外光下發(fā)射熒光，其熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，能夠被多種方法檢測(cè)。該報(bào)告基因檢測(cè)不需要底物，GFP表達(dá)穩(wěn)定，加熱、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶均不能使它滅活【22】。結(jié)合全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀或聚焦顯微鏡，還可對(duì)轉(zhuǎn)錄

19、調(diào)節(jié)因子進(jìn)行高通量分析口【25】。GFP報(bào)告基因的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠在活細(xì)胞條件下檢測(cè)以及細(xì)胞內(nèi)定位【26】。報(bào)告基因分析在體內(nèi)環(huán)境下直接測(cè)定轉(zhuǎn)錄活性水平，真實(shí)反映轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)活性，同時(shí)能夠進(jìn)行定量分析，是目前檢測(cè)NF-B的一種比較理想方法。結(jié)語(yǔ)自1986年首次發(fā)覺NF-B以來，圍繞它的研究日益深入。目前，對(duì)NF-B在腫瘤細(xì)胞中生物學(xué)特性的研究是一個(gè)熱點(diǎn)問題，同時(shí)也取得了一些研究進(jìn)展。NF-B參與機(jī)體的細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)、胚胎發(fā)生、細(xì)胞凋亡及病毒感染等多種重要的生理和病理反應(yīng)因此受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。因此，對(duì)NF-B進(jìn)一步的研究，對(duì)其激活和抑制機(jī)理的了解，將有助于治療炎癥，癌癥等各種疾病。參

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