1、擴(kuò)增子-物種注釋四部曲美格基因一、代表性序列注釋利用usearch對每個OTU的代表序列進(jìn)行物種分類，從而達(dá)到了解所有序列物種來源的目的。其中16S、18S和功能基因默認(rèn)采用RDPclassifier貝葉斯算法，ITS和AMF默認(rèn)采用Blast方法，置信度閾值為0.5。使用的數(shù)據(jù)庫：16S（細(xì)菌、古菌）和18S（真核）默認(rèn)用silva，ITS（真菌）默認(rèn)用unite，功能基因默認(rèn)用fungene（RDP整理來源于GeneBank的功能基因數(shù)據(jù)庫），AMF默認(rèn)用MaarjAM數(shù)據(jù)庫，得到物種注釋信息表otu_taxa。#OTUIDtaxonomyOTU1k_Fungi;p_Glomeromyco

2、ta;c_Glomeromycetes;o_Paraglomerales;fParaglomeraceae;gParaglomus;sAlguacil12aPara1OTU10kFungi;pGlomeromycota;cGlomeromycetesOTU100kFungi;pGlomeromycota;cGlomeromycetesOTU1000kFungi;pGlomeromycota;cGlomeromycetes;oGlomeralesOTU1001kFungi;pGlomeromycota;cGlomeromycetes;oGlomeralesOTU1002kFungi;pGlome

3、romycota;cGlomeromycetes;oGlomeralesOTU1003kFungi;pGlomeromycota;cGlomeromycetes注:otu_taxa中的taxonomy分為7個層次，分別為界（kingdom丄1），門（phylum丄2），綱（class，L3），g（order，L4），科（family，L5），屬（genus，L6），種（species，L7），以首字母簡寫標(biāo)注（如p_代表Phylum）。注釋結(jié)果中*_uncultured（如g_uncultured）表示注釋上了數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)被報道的暫未純培養(yǎng)的物種。分類學(xué)比對后根據(jù)置信度閾值篩選，會有某些分類譜

4、系在某一分類級別分值較低，在統(tǒng)計時以Unidentified標(biāo)記；Unclassified表示數(shù)據(jù)庫中沒有找到對應(yīng)于該序列的分類信息。UnclassifiedTags指沒有獲得注釋信息。若無此類標(biāo)記表示數(shù)據(jù)庫中沒有參考序列（如k_Bacteria;p_Proteobacteria表示在綱水平以下無物種信息）。二、去除污染OTU獲得OTUtable根據(jù)注釋結(jié)果去除注釋為葉綠體或線粒體（16S擴(kuò)增子）以及不能注釋到界級別的OTU及其Tags,得到最終序列分布情況表otu_table_final將otu_table_final表中各OTU的序列數(shù)與otu_taxa表中物種信息相結(jié)合，得到物種注釋綜合

5、信息表otu_table。#OTUIDBL1.1BL1.2BL1.3taxonomyOTU10356468383kFungi;pGlomeromycota;.OTU1008527kFungi;pGlomeromycota;.OTU1000000kFungi;pGlomeromycota;.OTU1001000kFungi;pGlomeromycota;.OTU1002000kFungi;pGlomeromycota;.OTU1003000kFungi;pGlomeromycota;.注：第一列為過濾污染序列以及不能注釋到界級別的OTU后的有效OTU編號，最后一列為每個OTU的物種注釋信息，其余

6、各列代表各個OTU在不同樣品中的序列數(shù)。對每個樣本而言，OTU豐度構(gòu)成該樣本的組成結(jié)構(gòu)，該結(jié)果是后續(xù)物種豐度研究的基礎(chǔ)。重抽通常以序列數(shù)最少的樣品為準(zhǔn)，利用usearch從otu_table中將其他樣品的序列數(shù)隨機(jī)抽平到相同數(shù)目,生成抽平（歸一化/均一化/標(biāo)準(zhǔn)化）后的otu_table_subsampled表。并根據(jù)OTU分類地位鑒定結(jié)果，統(tǒng)計各分類水平的微生物類群數(shù)和序列數(shù)。其中各分類水平的微生物類群數(shù)相當(dāng)于以不同的分辨率查看群落組成結(jié)構(gòu)，以直觀地比較不同樣本在同一水平的分類單元數(shù)的差異，各分類水平的序列數(shù)統(tǒng)計結(jié)果則可以根據(jù)注釋到屬的序列數(shù)多少，判斷各樣品物種注釋率的高低。#OTUIDBL1.1BL1.2BL1.3taxonomyOTU10332418327kFungi;pGlomeromycota;、OTU1005316kFungi;pGlomeromycota;、OTU1000000kFungi;pGlomeromycota;、OTU1001000kFungi;pGlomeromycota;、OTU1002000kFungi;pGlomeromycota;、OTU1003000kFungi;pGlomeromycota;、注：該結(jié)果是后續(xù)alpha多樣性、beta多樣性、統(tǒng)計