1、SequenomSNP實驗過程說明文件目錄一、實驗基本流程及原理（1二、實驗過程（21、引物設(shè)計（22、DNA提?。?3、PCR擴增（34、PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理（35、單堿基延伸（46、樹脂純化（57、芯片點樣（58、質(zhì)譜檢測（5三、附錄實驗所需的試劑、耗材和儀器設(shè)備（5一、實驗基本流程及原理SequenomMassARRAYSNP檢測過程結(jié)合多重PCR技術(shù)、MassARRAYiPLEX單堿基延伸技術(shù),和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflight,MALDI-TOF進行分型檢測。

2、將包含SNP位點區(qū)域的DNA模板通過PCR技術(shù)擴增，再使用特異的延伸引物與PCR產(chǎn)物進行單堿基延伸反應(yīng)。由于多態(tài)性位點堿基不同，延伸產(chǎn)物不同的末端堿基將導(dǎo)致延伸后的產(chǎn)物分子量的差異,因此由SNP多態(tài)性引起的堿基差異通過分子量的差異而體現(xiàn)，通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)，檢測延伸產(chǎn)物分子量的大小,應(yīng)用專用的分析軟件，通過判斷分子量的差異而進行SNP分型檢測。SNP檢測實驗基本步驟如下圖所示：圖1SequenomMassARRAYSNP檢測實驗基本步驟二、實驗過程1、引物設(shè)計使用Sequenom公司GenotypingTools及MassARRAYAssayDesign軟件設(shè)計

3、待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物，并交由生物公司合成。2、DNA提取使用WizardGenomicDNApurificationKit(Promega或NucleoSpinTissue(MN等試劑盒或類似產(chǎn)品，提取組織、細胞或血樣中的DNA。用分光光度計定量，瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢，基因組DNA電泳條帶通常不小于20kb。質(zhì)檢合格的DNA將濃度調(diào)整到50ng/pl，轉(zhuǎn)移至384孔板,-20C儲存?zhèn)溆谩書曠壇采用多巫pfR披朮，三酸汕皈申進訐,莓嚇反應(yīng)悴察總憚磁勺11.(1在一牛新酌l.nlFP管中SSdPCRmastermbt潛?dān)Q就劇PCR應(yīng)去陽mix蓿：PCSMIX訶超卒圧J3.

4、mLlOPCRBjffier0.5MCiJ(25inNJ04dNrPmixOSmM)C.lHotSarTitkJjpU0.1Watei-I.QPCft口FiVfkFm(3K1TotalVolumeA:D港用24通道柚權(quán)哉.閤節(jié)枷堆林為H了64扎西的毎牛仙抹九沖咖入KinaEtormixSi.謨3frlfL極即対PR廃J0複.1取出已啞剖卷肝旳DM幾祥品1&4JL使冊岀謹(jǐn)迢加徉韶嗣書加祥悴和盂呻1每個寧叱III技酣系中包誡悔DMA?S-50ng.日址曲丁鬥亦U,每親擴引物O.Slimol.OlplZSmMdHW(4fiJ樹孑師的PCRft上彊運PCW反應(yīng)焙件為創(chuàng)匚4歸種.的C2Q妙上M秒72C1

5、分腫，45亍區(qū)環(huán)：7于：占分神：4豐陽特.垮占84孔PC匕辰阪曲宜亍PCR僅上，啟動PCR疑止，4、PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理(1在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用SAP(shrimpalkalinephosphatase,蝦堿性磷酸酶處理,以去除體系中游離的dNTPs。(2配制堿性磷酸酶處理反應(yīng)液,SAPMix。SAPMix對每個反應(yīng),口1Water1.53SAPBuffer(lOx)0.17SAPEnzymeJl?JU/ul)03TotalVolume(3使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)加樣體積為2pL,將SAPMix加入384孔PCR反應(yīng)5APM&,plWalt-i1.55SAPBuFlerCIO

6、if0.1T5AFfftzymt-(1.7U/dI)0-JTbtalVAolurm2淘般2pl(SAP0,5U.bufferDQ斛打3S4fLfeiSH在誥旨3B4鎖昭代R僅上,iSSPCR痰IS泰忡37X40#巧氈弓分仲：4X14.啟動PCR惶進廳硏性隣酸陶肚理.L單說基延憚(1)旺翩期皈圉屮結(jié)康后.逬行單髓拙忡應(yīng)兩.飯府噸.鼬廨?Ml(2配到單謹(jǐn)封延咽藍國直.EJCTEI4DMx.EXTENDMix2施t良Ei.pLWaterE?tt?nprimerVHJ即2仲l：rLEXeuFrrpltis02IPVE5(CuminaTorD2JFlfXenzyme0.04訕日tfaliirne2(4將

7、384孔板放置在兼容384孔板的PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)條件:94Cfor30seconds94Cfor5seconds52Cfor5seconds80Cfor5secondsGOTOIII,4moretimesGOTOII,39moretimes72Cfor3minutesVII.4Cforever啟動PCR儀進行單堿基延伸反應(yīng)。6、樹脂純化(1將CleanResin樹脂平鋪到6mg的樹脂板中;(2加16卩1水到延伸產(chǎn)物的對應(yīng)孔內(nèi)；(3將干燥后的樹脂倒入延伸產(chǎn)物板中,封膜,低速垂直旋轉(zhuǎn)30分鐘,使樹脂與反應(yīng)物充分接觸；(4離心使樹脂沉入孔底部。7、芯片點樣啟動MassARRAYNanodi

8、spenserRS1000點樣儀,將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom芯片上。8、質(zhì)譜檢測將點樣后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeoffligh，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析,檢測結(jié)果使用TYPER4.0軟件(sequenom分型并輸出結(jié)果。三、附錄實驗所需的試劑、耗材和儀器設(shè)備關(guān)鍵試劑CodeReagentsManufacturerCatNo.1CompleteiPLEXGoldGenotypingReagentSet384Sequenom10148-2關(guān)鍵儀器CodeInstrumentsManufacturer1S1000TMThermalCyclerBIORAD2PipettesinglechannelEpp