1、重組子的篩選與鑒定 一、 遺傳學(xué)檢測(cè)法二、 物理檢測(cè)法 三、 核酸分子雜交檢測(cè)法四、免疫化學(xué)檢測(cè)法五、 核酸序列分析及其他方法第三節(jié) 重組子的篩選與鑒定相關(guān)概念轉(zhuǎn)化子導(dǎo)入外源基因DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞；重組子含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子；篩選和選擇經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需的陽(yáng)性重組子的過程；篩選通過某種特定的方法，如核酸雜交及免疫測(cè)定等從受體細(xì)胞群體或基因文庫(kù)中鑒定出陽(yáng)性重組子的過程；選擇通過某種外加因素的辨別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆的方法一、遺傳學(xué)檢測(cè)法該方法要求克隆基因能夠表達(dá)，并利用相應(yīng)的基因突變型作為受體細(xì)胞，當(dāng)受體細(xì)胞由突變型變?yōu)橐吧?/p>

2、型時(shí)或賦予受體細(xì)胞特定的表型時(shí)，我們基本可以確定所克隆的基因是否是目的基因。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果較可靠。 缺點(diǎn)：基因必須表達(dá)并具有合適的受體細(xì)胞。（一） 根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法 1. 抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法 2. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法（二）根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法 轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變體發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。一、遺傳學(xué)檢測(cè)法(一)載體表型選擇法1.抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法 如：pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。

3、 Tetr上有插入位點(diǎn)BamH I和Sal I; Ampr上有插入位點(diǎn)Pst I。一、遺傳學(xué)檢測(cè)法(一)載體表型選擇法1.抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法pBR322抗菌素標(biāo)記選擇（1）四環(huán)素：抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。（2）氨芐青霉素抗性基因：產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔沟?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。（3）環(huán)絲氨酸：殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。一、遺傳學(xué)檢測(cè)法 (一)載體表型選擇法1.抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法 pBR322 選擇過程 （1）四環(huán)素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四

4、環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。 Tetr失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，反而被環(huán)絲氨酸殺死。 一、遺傳學(xué)檢測(cè)法無(wú)環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基一、遺傳學(xué)檢測(cè)法(一)載體表型選擇法1.抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法 pBR322 選擇過程（2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。一、遺傳學(xué)檢測(cè)法(一)載體表型選擇法2. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶 乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)+深藍(lán)色+（1）原理載體上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac

5、Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。 受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）, 可以被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)形成完整有功能的-半乳糖苷酶。一、遺傳學(xué)檢測(cè)法(一)載體表型選擇法2. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法（2） 選擇過程假陽(yáng)性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)并且沒有終止密碼子；（不破壞肽）。一、遺傳學(xué)檢測(cè)法(一)載體表型選擇法2. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。一、遺傳學(xué)檢測(cè)法(二)根據(jù)插入基因的遺傳性狀的選擇利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)行直接選擇。（只在特定條件下）。1.原理（1）彌補(bǔ)缺陷轉(zhuǎn)化

6、進(jìn)來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。his-his+受體菌：外源基因：陽(yáng)性克隆才能在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一、遺傳學(xué)檢測(cè)法(二)根據(jù)插入基因的遺傳性狀的選擇1.原理（2）增加新性狀使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。 例：小鼠的二輕葉酸還原酶（DHFR）對(duì)三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。DHFR載體連接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板含DHFR的克隆才能生長(zhǎng)二、物理檢測(cè)法利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。(一)凝膠電泳檢測(cè)法 從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。載體重組克隆分子量 Marker二、物理檢測(cè)法(二)酶切電泳篩選法1. 原理根據(jù)已知的外

7、源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長(zhǎng)度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個(gè)片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。二、物理檢測(cè)法A或B(二)酶切電泳篩選法二、物理檢測(cè)法三、核酸分子雜交檢測(cè)法1. 核酸雜交(一)原理重組克隆與探針雜交。3. 識(shí)別標(biāo)記32P 或 125I 。（1）放射性同位素2. 檢測(cè)用的探針與外源DNA插入片斷互補(bǔ)的序列。（2）非放射性標(biāo)記熒光素三、核酸分子雜交檢測(cè)法(二)核酸雜交檢測(cè)方法1. Southern blotting用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA樣品。從宿主細(xì)胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探

8、針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。三、核酸分子雜交檢測(cè)法Southern blotting三、核酸分子雜交檢測(cè)法Southern blot 篩選結(jié)果(二)核酸雜交檢測(cè)方法1. Southern blotting三、核酸分子雜交檢測(cè)法(二)核酸雜交檢測(cè)方法2.Northern blotting用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。 從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。3. Western blotting在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測(cè)膠上的蛋白質(zhì)泳帶。（SDS）三、核酸分子雜交檢測(cè)法(二)核酸雜交檢測(cè)方法 SDS:是

9、蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：在電場(chǎng)的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動(dòng)，移動(dòng)的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L(zhǎng)短），從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer3. Western blotting(二)核酸雜交檢測(cè)方法膜膠蛋白 轉(zhuǎn)膜 雜交待測(cè)蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗 檢測(cè)3. Western blotting(二)核酸雜交檢測(cè)方法三、核酸分子雜交檢測(cè)法(二)核酸雜交檢測(cè)方法4.原位雜交 特點(diǎn)：對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。四、免疫化學(xué)檢測(cè)法 利用免疫

10、學(xué)的原理，檢測(cè)克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物。蛋白蛋白“雜交” 利用抗體作為“探針”來檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。 (一)放射性抗體檢測(cè)法1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式 根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為以下幾種作用方式： 四、免疫化學(xué)檢測(cè)法待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)記的二 抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)記的二抗固相支持濾膜待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)記的二抗 結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗(一)放射性抗體檢測(cè)法1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式四、免疫化學(xué)檢測(cè)法(一)放射性抗體檢測(cè)法 2. 放

11、射性抗體檢測(cè)法過程四、免疫化學(xué)檢測(cè)法(一)放射性抗體檢測(cè)法3. Broome-Gilbert雙位點(diǎn)檢測(cè)法檢測(cè)融合蛋白。既檢測(cè)外源基因產(chǎn)物又檢測(cè)載體基因產(chǎn)物。質(zhì)?；駻插入基因B表達(dá)質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白四、免疫化學(xué)檢測(cè)法固相支 持濾膜抗A抗體125I標(biāo)記的 抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支 持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光(一)放射性抗體檢測(cè)法3. Broome-Gilbert雙位點(diǎn)檢測(cè)法四、免疫化學(xué)檢測(cè)法(二)免疫沉淀檢測(cè)法檢測(cè)分泌型產(chǎn)物。1. 原理：抗原抗體凝集反應(yīng)。2. 方法把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周圍時(shí)，就會(huì)與抗體反應(yīng)

12、形成“沉淀圈”。對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。四、免疫化學(xué)檢測(cè)法(三)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：一抗（primary antibody）: 與目標(biāo)分子特異結(jié)合。 二抗（secondary antibody）： 與一抗特異性結(jié)合。 酶連（enzyme-linke）： 二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。四、免疫化學(xué)檢測(cè)法待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶 待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗

13、二抗無(wú)色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶 四、免疫化學(xué)檢測(cè)法(三)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）2. ELISA檢測(cè)的一般步驟（1）固定樣品將待測(cè)樣品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底?？椎姿?、免疫化學(xué)檢測(cè)法(三)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）2. ELISA檢測(cè)的一般步驟（2）一抗結(jié)合加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。一抗四、免疫化學(xué)檢測(cè)法(三)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）2. ELISA檢測(cè)的一般步驟（3）二抗結(jié)合加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識(shí)別一抗。二抗二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。四、免疫化學(xué)

14、檢測(cè)法(三)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）2. ELISA檢測(cè)的一般步驟（4）顯色反應(yīng)加入無(wú)色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。四、免疫化學(xué)檢測(cè)法四、免疫化學(xué)檢測(cè)法(三)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）2. ELISA檢測(cè)的一般步驟（5）比色在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。四、免疫化學(xué)檢測(cè)法 (三)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）3. ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。 必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonal antibody）四、免疫化學(xué)檢測(cè)法臨床檢驗(yàn)常用的單抗五、核酸序列分析及其他方法(一)PCR擴(kuò)增檢測(cè)法1. 原理：PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片斷。2. 過程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片斷引物作PCR。