1、涼燥致病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究【關(guān)鍵詞】涼燥致病機(jī)制Keyrds：l-Dry;Pathgeniehanis1材料與方法1.1動(dòng)物無特定病原體級(jí)SPF昆明種小鼠216只，體重181g，雌雄各半，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，答應(yīng)證號(hào)：SXK鄂2022-2022。1.2儀器與試劑1.3菌株金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(AT25923，北京天壇生物制品公司)。1.4方法1.4.1動(dòng)物模型及分組1.4.2病理組織學(xué)觀察斷頸處死小鼠，常規(guī)取氣管1.5，右肺組織中4010g/只、背部皮膚0.50.5及左足墊皮膚，HE染色、鏡檢。1.4.3氣管上皮纖毛運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)iliaveentfTrahealEpitheliu,in/：按

2、文獻(xiàn)方法2。1.4.4氣道液黏多糖Respiratryseretinfuplysahride,RS,g/l測(cè)定：咔唑比色法，參考文獻(xiàn)方法2。1.4.5氣道液IgGIgG-R檢測(cè)常規(guī)氣管插管，取灌洗液別離上清，按酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA試劑盒說明書檢測(cè)。以包被液作空白對(duì)照，PBSpH7.410%小牛血清作陰性對(duì)照。每份樣品檢測(cè)3次，記錄標(biāo)本均值與陰性對(duì)照P/N倍數(shù)之平均值。1.4.6血液流變學(xué)檢測(cè)3受血液流變儀對(duì)血量標(biāo)本的限制，每組取9只小鼠眼球血合為1份標(biāo)本進(jìn)展測(cè)試，3份/組。肝素抗凝管取眼球血，4h內(nèi)測(cè)定血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞剛性指數(shù)。1.4.7細(xì)菌攻擊實(shí)驗(yàn)1.4.8氣管細(xì)胞凋亡

3、檢測(cè)第14天取氣管切片，按脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法TUNEL試劑盒程序操作。結(jié)果判斷：氣管上皮細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為TUNEL染色陽性。鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算：細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)200100%1.4.9氣管細(xì)胞bl-2基因，bax基因表達(dá)檢測(cè)第14天常規(guī)取氣管標(biāo)本切片、按試劑盒說明書操作。結(jié)果判斷：氣管上皮細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為bl-2或bax表達(dá)陽性。鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算：陽性指數(shù)PI=陽性細(xì)胞數(shù)記數(shù)細(xì)胞數(shù)100%1.4.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示，采用SPSS13.0軟件，資料之間比擬用ANVA分析，顯著性檢驗(yàn)采用多個(gè)樣本均數(shù)間q檢驗(yàn)Nea

4、n-Keuls法；各組第7天與第14天比擬用t檢驗(yàn)，P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)=0.05。2結(jié)果2.1氣管、肺構(gòu)造觀察常溫常濕組第7、第14天氣管上皮構(gòu)造完好、纖毛整齊，氣管腺體、細(xì)支氣管與肺泡未見異常，背部皮膚構(gòu)造完好，毛球數(shù)多，新生毛干數(shù)豐富且層次明晰，足墊皮膚汗腺豐富。常溫燥組第14天部分氣管纖毛倒伏、黏連，肺泡輕度淤血，皮膚未見異常；涼燥組第14天氣管上皮鱗狀化生，氣管纖毛多呈灶狀缺損，20%氣管漿液腺上皮黏液腺化生，肺部淤血、水腫明顯，均較第7天嚴(yán)重；背部皮膚無明顯異常，但足墊部皮膚腺體明顯減少與皮下結(jié)締組織增生。2.3涼燥對(duì)小鼠血液流變學(xué)的影響見表3。與常溫常濕

5、組比擬，涼燥組血液流變學(xué)指標(biāo)改變無顯著性。表3涼燥對(duì)小鼠血液黏度的影響(略)2.4涼燥相兼細(xì)菌攻擊對(duì)小鼠肺細(xì)菌數(shù)BQ、呼吸道液黏多糖RS與IgG-R的影響見表4。表4細(xì)菌攻擊對(duì)涼燥小鼠BQ、RS與IgG-R的影響略2.5涼燥對(duì)氣管細(xì)胞凋亡與bl-2基因、bax基因表達(dá)的影響見表5。表5涼燥對(duì)小鼠氣管上皮細(xì)胞bl-2、bax基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡的影響(略)3討論按表1條件處理，病理檢查可見涼燥組第14天氣管上皮鱗狀化生與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管纖毛多呈灶狀缺損，肺泡充血、水腫明顯，說明涼燥傷肺、傷津，肺失其濡養(yǎng)而致組織細(xì)胞構(gòu)造受損；20%氣管漿液腺上皮黏液腺化生，提示與涼燥肺津生成障礙相關(guān)；足墊皮膚汗腺

6、明顯減少與結(jié)締組織增生等，說明肺宣輸失司、皮毛腠理失之濡潤(rùn)，合以衛(wèi)表不固，致“燥氣先傷于華蓋。本結(jié)果為涼燥致病提供組織學(xué)證據(jù)。氣道液內(nèi)含黏蛋白主為黏多糖和蛋白質(zhì)，覆蓋于黏膜外表形成黏液毯，是氣道的重要保護(hù)性屏障之一；RS與氣道液分泌呈正相關(guān)，其主要作用是潮濕氣道黏膜、保護(hù)上皮的纖毛運(yùn)動(dòng)。與常溫常濕組比擬，涼燥組第7天RS減少，顯示涼燥早期氣道液分泌嚴(yán)重減少而具“干之特點(diǎn)。值得注意的是涼燥組第14天RS明顯增多P0.01，其機(jī)理可能是涼燥之邪的涼氣可傷肺陽而致肺津不化、凝聚成痰飲，故氣道液明顯增加。氣道纖毛受“涼凝之氣道液刺激而病理性運(yùn)動(dòng)加快。涼燥組細(xì)菌攻擊后RS明顯減少，也提示生物病原攻擊可加

7、重氣道分泌障礙與“正氣受損5。IgG-R是氣道重要免疫防御成分之一，涼燥組第714天以及細(xì)菌攻擊后RS增高，與機(jī)體的保護(hù)性反響有關(guān)。涼燥相兼細(xì)菌攻擊，外那么衛(wèi)滯邪郁，內(nèi)那么津少氣虛，抗邪無力那么病邪入里；肺津不化那么凝成痰飲，細(xì)菌及其毒素可加重肺津生成障礙與宣輸失司更甚，加之氣道部分御邪屏障受損那么對(duì)生物病原攻擊的敏感性增高，但故涼燥組肺細(xì)菌數(shù)是常溫常濕組的7.1倍，結(jié)果提示涼燥病機(jī)之一與損傷氣道分泌與“纖毛-黏液毯有關(guān)。涼燥組血液黏度變化不明顯，但紅細(xì)胞剛性指數(shù)增高，提示血液運(yùn)行障礙，其機(jī)理有待研究。bl-2屬于低豐度表達(dá)基因，編碼的bl-2/bax家族蛋白如bl-2/bax二聚體為抑制細(xì)胞

8、凋亡構(gòu)型，bax/bax二聚體可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，常溫常濕組與涼燥組氣管細(xì)胞凋亡率均較低0.3%，但涼燥組氣管bl-2陽性細(xì)胞多見于氣管纖毛缺損或鱗狀上皮化生處，提示與涼燥致病機(jī)制相關(guān)。結(jié)果說明，涼燥主要病機(jī)可能是：涼燥傷津，涼燥之邪的涼氣可傷肺陽而致肺津不化，凝集成痰飲，合以宣輸失司，皮毛腠理失養(yǎng)而致衛(wèi)表不固；肺津生成銳減，氣道“纖毛-黏液毯生物防御屏障受損，合以對(duì)生物病原攻擊敏感性增加等綜合因素致玻涼燥致氣管細(xì)胞bl-2基因表達(dá)下調(diào)與涼燥致病機(jī)制的相關(guān)性值得研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1丁建中，張六通，邱幸凡，等.外燥對(duì)小鼠氣管上皮纖毛運(yùn)動(dòng)與呼吸道液分泌的影響J.中醫(yī)雜志，2022，488：607.2徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1360.3童一秋.醫(yī)院體檢化