1、環(huán)境激發(fā)嗎啡條件性位置偏愛重現(xiàn)大鼠海馬PSD-95的蛋白和DNA表達(dá)【摘要】目的:檢測嗎啡條件性位置偏愛nditinedplaepreferene，PP重現(xiàn)大鼠海馬區(qū)突觸后致密質(zhì)-95PSD-95的蛋白和DNA表達(dá)，觀察PSD-95對嗎啡成癮記憶的影響。方法:建立大鼠嗎啡PP模型，自然消退后，通過環(huán)境來誘發(fā)PP的重現(xiàn)，應(yīng)用免疫組化和RT-PR的方法，觀察嗎啡PP重現(xiàn)組大鼠海馬區(qū)PSD-95的表達(dá)，并與嗎啡PP消退組、生理鹽水對照組進(jìn)展比擬。結(jié)果:嗎啡PP環(huán)境激發(fā)組、嗎啡PP消退組與生理鹽水對照組相比，以及嗎啡PP環(huán)境激發(fā)組與嗎啡PP消退組相比，海馬區(qū)PSD-95的表達(dá)明顯降低，差異具有高度顯著

2、性(P0.01)。結(jié)論:嗎啡PP重現(xiàn)和消退大鼠海馬區(qū)PSD-95表達(dá)明顯降低，海馬區(qū)PSD-95可能未參與成癮記憶?！娟P(guān)鍵詞】嗎啡條件性位置偏愛環(huán)境激發(fā)海馬突觸后致密質(zhì)-95Abstrat:bjetive:TbservetheexpressinfprtEinandDNAfpstsynaptidensityprtein-95(PSD-95)inhippapusfratsithrphinenditinedplaepreferene(PP)afterenvirnentinduedreinstateent,andtevaluatetheinfluenefPSD-95nadditinery.ethds:

3、PPratdelasestablishedithrphineinjetinandreinstateentasinduedbyenvirnentafterextintinfPP.TheexpressinfPSD-95prteinandDNAinhippapusfratsinreinstateentgrupfrphinePPerebserved,andasparediththseinextintingrupfrphinePPandntrlgrup.Results:TheexpressinfPSD-95inhippapusassignifiantlydereasedinratsinreinstate

4、entandextintingrupfrphinePPparediththseinntrlgrup(P0.01),anditassignifiantlydereasedinreinstateentgrupparediththseinextintingrup(P0.01).nlusin:TheexpressinfPSD-95inhippapusissignifiantlydereasedinratsinreinstateentandextintingrupfrphinePP.PSD-95inhippapushastakepartrntinadditery.Keyrds:rphine;nditin

5、edplaepreferene;envirnentalindue;hippapus;pstsynaptidensityprtein-95毒品成癮研究的一個(gè)最大挑戰(zhàn)是毒品濫用引起的復(fù)燃，但到目前為止，復(fù)燃的神經(jīng)機(jī)制尚不清楚。藥物成癮是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)、心理學(xué)和社會學(xué)問題，近年來越來越多的證據(jù)說明，學(xué)習(xí)記憶在成癮行為的形成和保持中發(fā)揮重要作用。聯(lián)絡(luò)著環(huán)境刺激和濫用毒品效應(yīng)的不良適應(yīng)性記憶被公認(rèn)為是引起毒品成癮習(xí)慣復(fù)燃和持久的主要原因1。本實(shí)驗(yàn)通過利用SD大鼠嗎啡條件性位置偏愛nditinedplaepreferene，PP-消退-環(huán)境激發(fā)模型，研究嗎啡成癮記憶重現(xiàn)狀態(tài)下，大鼠海馬區(qū)突觸后致密質(zhì)95

6、PSD-95的表達(dá)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物選用安康普通級SD大鼠24只3月齡，雌雄不限，體重為(25020)g221275g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。按隨機(jī)抽樣分組原那么，分為生理鹽水對照組(N組)、嗎啡PP環(huán)境激發(fā)組(R組)和嗎啡PP消退組(E組)，每組8只，分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。觀察其活動、飲食量、飲水量和大便等情況。1.2實(shí)驗(yàn)試劑鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠消費(fèi))，鹽酸納洛酮北京四環(huán)制藥廠消費(fèi)，免疫組化抗體北京博奧森生物技術(shù)消費(fèi)，Trizl(上海生物工程消費(fèi))，RT-PR試劑盒(上海Prega生物產(chǎn)品消費(fèi))，引物序列上海生物工程合成，PSD-95上游引物序列：5-AAGAGAA

7、TAAGGA-3，下游引物序列：5-AGGAAGGGGAAT-3，預(yù)計(jì)目的片段長289bp，-atin為內(nèi)參照上游引物序列：5-TAAATGTGATTAGA-3，下游引物序列：5-ATGGAAGTGTTGAATAG-3，預(yù)計(jì)目的片段長385bp。1.3PP實(shí)驗(yàn)箱及預(yù)實(shí)驗(yàn)1.4嗎啡PP模型的建立、消退和激發(fā)單位：gkg-1：5、5、10、10、15、15、20、20、30、30、40、40、50、50。PP的訓(xùn)練與依賴模型的建立同時(shí)進(jìn)展，在每次注射嗎啡后將大鼠放入白箱內(nèi)50in，間隔2h后，再注射生理鹽水放入黑箱內(nèi)50in。嗎啡依賴大鼠第8天于嗎啡注射前2h注射鹽酸納洛酮5gkg-1，進(jìn)展催促試

8、驗(yàn)來誘發(fā)戒斷病癥，對濕狗樣顫抖、清理皮毛、站立、吞咽、跳躍、齒顫、上瞼下垂、流涎、腹瀉等病癥給予評分。1.5免疫組化方法測試后大鼠灌注固定，取腦，參照鼠腦立體定位圖譜，取海馬區(qū)域組織，包埋切片，操作按試劑盒說明書進(jìn)展，蘇木素復(fù)染后觀察拍片。1.6提取RNA，RT-PR方法檢測PSD-95測試后大鼠麻醉后斷頭處死，于冰上快速開顱取腦并別離出海馬區(qū)，提取RNA、RT-PR方法和操作按試劑盒說明書進(jìn)展，分析軟件為Gel-pr3.1分析系統(tǒng)。比擬。2結(jié)果2.1嗎啡PP模型戒斷病癥評分及白箱內(nèi)停留時(shí)間見表1。2.2PSD-95蛋白質(zhì)免疫組化表達(dá)結(jié)果在各組實(shí)驗(yàn)鼠海馬區(qū)，神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)均可見棕黃色免疫反響產(chǎn)

9、物沉積。N組棕黃色顆粒明顯而密集見圖1a，E組棕黃色顆粒稍密集見圖1b，R組棕黃色產(chǎn)物淺淡而稀疏見圖1。2.3RT-PR檢測海馬區(qū)PSD-95DNA表達(dá)結(jié)果見表2和圖2。3討論臨床和實(shí)驗(yàn)證明，嗎啡的成癮記憶非常生動和強(qiáng)烈，可以終生不忘，即使相隔數(shù)十年，只要回到相關(guān)的環(huán)境，即可激發(fā)強(qiáng)烈的渴求感，聯(lián)絡(luò)著環(huán)境刺激和濫用毒品效應(yīng)的不良適應(yīng)性記憶被公認(rèn)為是引起毒品成癮復(fù)燃和持久的主要原因。海馬是參與毒品依賴的一個(gè)重要腦區(qū)，又是學(xué)習(xí)記憶的一個(gè)關(guān)鍵區(qū)域，本實(shí)驗(yàn)利用SD大鼠嗎啡PP的建立-消退-環(huán)境激發(fā)模型，研究嗎啡成癮記憶重現(xiàn)狀態(tài)下，大鼠海馬區(qū)PSD-95的蛋白和DNA表達(dá)，從而討論P(yáng)SD-95是否參與了嗎

10、啡的成癮記憶。PSD是位于突觸活性區(qū)突觸后膜下方的一種亞微構(gòu)造，對應(yīng)激反響很敏感，多種外界刺激可引起不同腦區(qū)PSD的變化。PSD-95在信號傳導(dǎo)、N-甲基-D-天冬氨酸NDA誘導(dǎo)的長時(shí)程增強(qiáng)中起著重要作用，并對突觸傳遞和可塑性具有重要影響，并參與了學(xué)習(xí)與記憶、皮質(zhì)環(huán)路的形成。研究證明，敲除脊髓PSD-95能阻止大鼠嗎啡耐受的形成，說明PSD-95也參與了嗎啡成癮2。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，嗎啡PP激發(fā)組和消退組大鼠海馬區(qū)PSD-95表達(dá)明顯降低，與生理鹽水對照組比照，差異具有高度顯著性(P0.01)，其原因與嗎啡的損害有關(guān)。嗎啡依賴形成過程中，海馬神經(jīng)細(xì)胞由于缺血低氧而出現(xiàn)變性壞死和退行性改變3，而PSD

11、-95的活性和含量是受神經(jīng)元活性控制的，隨著神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少和活性降低，PSD-95的表達(dá)也會隨之降低。嗎啡對學(xué)習(xí)記憶的損害早已被證實(shí)，PSD-95表達(dá)明顯降低，反映了突觸后膜NDA受體數(shù)量的減少和位置發(fā)生改變，這既會影響長時(shí)程增強(qiáng)的形成，也會影響遞質(zhì)和受體的準(zhǔn)確結(jié)合，最終在行為上表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶障礙。嗎啡對學(xué)習(xí)記憶的影響是雙重的，一方面可以對學(xué)習(xí)記憶造成損害，另一方面，屢次給予嗎啡卻可引起記憶恢復(fù)和重新穩(wěn)固4，5，一些不良適應(yīng)性記憶卻得到了加強(qiáng)，導(dǎo)致依賴者有著強(qiáng)烈的藥物渴求和復(fù)吸傾向。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，嗎啡PP環(huán)境激發(fā)組與生理鹽水對照組比照，海馬區(qū)PSD-95的表達(dá)明顯降低，差異具有高度顯著性(P0

12、.01)。這一結(jié)果卻出乎我們的意外。本實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察顯示，嗎啡PP環(huán)境激發(fā)組比嗎啡PP消退組在白箱內(nèi)停留時(shí)間明顯延長，差異具有高度顯著性，說明環(huán)境誘發(fā)了記憶的恢復(fù)和重新穩(wěn)固，理論上說參與成癮記憶的成分表達(dá)應(yīng)該增高，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻與此相反。海馬是參與精神依賴的一個(gè)腦區(qū)，也是嚙齒類動物空間學(xué)習(xí)記憶的中樞，且嗎啡成癮對空間學(xué)習(xí)記憶的損害也早已被證實(shí)6，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明成癮記憶與空間記憶存在有分層現(xiàn)象，海馬區(qū)PSD-95的表達(dá)進(jìn)一步降低，可能為空間記憶或其他類型記憶進(jìn)一步被損傷所致。研究說明，成癮記憶相關(guān)蛋白和基因的異常表達(dá)是藥物成癮長期存在的重要原因，成癮記憶在一定條件下是可以改變的，并和一般的空間記

13、憶或情緒記憶的機(jī)制存在差異7-9，我們的研究也說明了這一點(diǎn)。另外，海馬區(qū)PSD-95的表達(dá)明顯降低，說明海馬區(qū)PSD-95可能未參與成癮記憶。以前的研究說明，PSD-95不僅參與了學(xué)習(xí)記憶也參與了嗎啡成癮，而既參與精神依賴又參與學(xué)習(xí)記憶的腦區(qū)，除了海馬外，還有杏仁核、紋狀體、額葉皮質(zhì)等。對于其他腦區(qū)的PSD-95是否參與成癮記憶，以及海馬區(qū)其他的一些既參與嗎啡依賴又參與學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)遞質(zhì)是否參與了成癮記憶，我們將作進(jìn)一步的研究。【參考文獻(xiàn)】1LeeJL,DiianP,ThasKL,etal.Disruptingrenslidatinfdrugeriesreduesaine-seekingbeh

14、avirJ.Neurn,2022,47(6):795-801.2LiaJ,ZhangB,TaF,etal.KnkdnfspinalrdpstsynaptidensityprtEin-95preventsthedevelpentfrphinetleraneinratsJ.Neursi,2022,123(1):11-15.3朱華,李利華,楊舉倫,等.不同時(shí)程嗎啡依賴大鼠依賴相關(guān)腦區(qū)的病理組織學(xué)觀察J.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2022,35(2):88-91.4ZarrindastR,Farahandfar,RstaiP,etal.Theinfluenefentraladinistratinfdpainer

15、giandh-linergiagentsnrphine-induedanesiainrphine-sensitizedieJ.JPsyhpharal,2022,20(1):59-66.5ZarrindastR,KhalilzadehA,RezayatS.Influenefintraerebrventriularadinistratinfhistainergidrugsnrphinestate-dependenteryinthestep-dnpassiveavidanetestJ.Psyhpharalgy,2022,74(2):106-112.6馬光瑜,樊小力,徐小虎,等.嗎啡成癮對大鼠及小鼠學(xué)習(xí)與記憶才能影響的實(shí)驗(yàn)研究J.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2000,9(5):329-331.7NestlerEJ.nleularandellarsubstratesfaddi-tinanderyJ.NeurbiLearne,2002,78