1、免疫組化技術(shù)及注意事項免疫組化技術(shù)及注意事項免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原 (多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究。根據(jù)標(biāo)記物的不同分為：免疫酶法、免疫熒光法、親和組織化學(xué)法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三種最常用。免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗原抗體的特異性結(jié)合抗原抗體的特異性結(jié)合免疫酶法 以酶作為標(biāo)記物與外加底物作用后產(chǎn)生不溶性色素，沉積于抗原和抗體反應(yīng)的部位 酶降解底物的量與色澤濃度成正比，可反映被測定的抗原或抗體的量 常用的

2、標(biāo)記酶：HRP、AP、GOD酶標(biāo)抗體法非標(biāo)記抗體酶法免疫酶染色方法直接法間接法酶橋法 PAP法 (過氧化酶抗過氧化酶法 )免疫酶法 酶標(biāo)抗體法非標(biāo)記抗體酶法免疫酶染色方法直接法間接法免疫熒光法用于免疫熒光的標(biāo)記物是小分子的熒光素，可標(biāo)記抗體或抗原 熒光素經(jīng)某種特定波長的光照射激發(fā)后，能發(fā)射出一種比激發(fā)光波波長更長而且能量較低的熒光，籍此可作定位觀察或示蹤 借助于熒光顯微鏡進行觀察 常用的熒光素 ：異硫氰酸熒光素 (FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC)、四乙基羅丹明 (RB200) 、碘化丙啶 (PI) 等免疫熒光染色法常用的有直接法和間接法 免疫熒光法延髓A2區(qū)中Fos和TH熒光染

3、色延髓A2區(qū)中Fos和TH熒光染色大腦神經(jīng)干細(xì)胞大腦神經(jīng)干細(xì)胞親和組織化學(xué)法是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位。常用的有：親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù) (ABC法)、鏈親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù) (SP法) 。親和組織化學(xué)法束縛-浸水應(yīng)激引起的孤束核中Fos蛋白的表達(SP法)束縛-浸水應(yīng)激引起的孤束核中Fos蛋白的表達(SP法)小鼠海馬神經(jīng)GFAP蛋白表達 小鼠海馬神經(jīng)GFAP蛋白表達 1、實驗前準(zhǔn)備1.1 查閱相關(guān)文獻資料中文：山師圖書館中文電子資源，清華同方、 北京萬方、重慶維普期刊全文數(shù)據(jù)

4、庫。英文：National Center for Biotechnology Information () 山師圖書館外文電子資源，Springer、 ProQuest、Kluwer全文數(shù)據(jù)庫，或試用電 子資源。1、實驗前準(zhǔn)備1.1 查閱相關(guān)文獻資料免疫組化技術(shù)及注意事項課件1.2 所用抗體的選擇和購買參考文獻設(shè)計實驗選擇抗體種屬來源：一抗常見兔、鼠、山羊、豚鼠單或多克隆抗體：前者貴特異性高，后者相反雙標(biāo)或三標(biāo)的要求：不同的一抗種屬來源二抗選擇和目標(biāo)一抗同型或同亞型的抗體，IgM，IgG1，2a，2b等。公司：最好是國外著名生產(chǎn)抗體的大公司1.2 所用抗體的選擇和購買購買抗體抗體的實際使用范圍

5、：IHC-P, IHC-Fr, ICC, IF, IP, WB, E特異性，交叉反應(yīng)一抗、二抗都能找到對應(yīng)動物源后再訂購索取抗體一般已發(fā)表文獻中描述的抗體，只需向作者禮貌地提出申請均能獲得，只有當(dāng)多抗已用盡或供應(yīng)非常短缺，作者才會婉轉(zhuǎn)拒絕。購買抗體制備抗體多克隆抗體的制備 多克隆抗肽的抗血清是用天然蛋白抗原或肽-載體蛋白偶聯(lián)物作為抗原來制備得來的?？蓱?yīng)用肌肉注射和皮下組織注射免疫法制備抗血清，然后用親和層析法進行特異性抗體純化制備抗肽抗體的流程圖 制備抗體免疫組化技術(shù)及注意事項課件單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)1.3 抗體的保存抗體濃度越高（濃度大于10mg/ml），越穩(wěn)定，易保存；濃度低時，應(yīng)

6、加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保護劑；必要時需要加0.01-0.15NaN3防腐劑以延長保存時間。酶標(biāo)記抗體在應(yīng)用防腐劑時要注意不能用NaN3，否則會抑制酶的活性?？贵w濃縮液-20保存兩年，融解后抗體于2-8可以保存一個月，稀釋抗體在4下可存放1-3天，超過7天效價顯著降低。1.3 抗體的保存1.4 抗體的分裝閱讀抗體的說明書：背景、抗原、應(yīng)用、保存分裝：在潔凈的環(huán)境下無菌操作，是否避光液體抗體：冰盒內(nèi)直接分裝，最少 10L/每管干粉抗體：重構(gòu) (最好用超濾水)，加甘油 (-20)分裝的抗體密封，存儲 (4 or -20)，熒光抗體錫箔紙包裹避光用時取出一管， 存于4，避免反復(fù)凍融，用前

7、稀釋。1.4 抗體的分裝免疫組化技術(shù)及注意事項課件2、預(yù)實驗2.1 掌握各種技術(shù)制作束縛-浸水應(yīng)激模型2、預(yù)實驗2.1 掌握各種技術(shù)灌流固定腦組織：免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，常規(guī)4%多聚甲醛/PBS。長時間固定會使組織抗原的檢出強度逐漸降低。腦組織和腦切片的保存：包埋劑包埋快速冷凍，-20保存防凍液 (20%丙三醇、30%乙二醇、50%PBS)中-20保存異戊烷中-70 保存貼片腦切片室溫晾干，-20 -80的冰箱保存灌流固定腦組織：免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，常規(guī)4%多聚甲醛/腦立體定位冰凍切片減少冰晶:速凍或2030%蔗糖溶液4 脫水防止切片脫落：清洗載玻片，粘附劑處理腦切片染色：中性紅、焦

8、油紫、蘇木精等腦立體定位中性紅染色的大鼠腦切片中性紅染色的大鼠腦切片2.2 免疫組化的方法貼片法： 孵育盒放平，防止切片干涸 2.2 免疫組化的方法漂片法：輕搖小瓶或培養(yǎng)板，使切片充分接觸抗體，沖洗充分漂片法：輕搖小瓶或培養(yǎng)板，使切片充分接觸抗體，沖洗充分2.3 抗體最佳稀釋度確定直接測定法：用已知陽性抗原切片進行免疫染色，標(biāo)準(zhǔn)是該濃度可使抗原特異且明顯染色但背景無染色一抗稀釋度特異性染色非特異性染色1:100+1:500+1:1000+1:2000+ (-)1:3000+ (-)陰性對照 (-) (-)2.3 抗體最佳稀釋度確定一抗稀釋度特異性染色非特異性染色1棋盤法：測定兩種以上抗體的最佳

9、配合稀釋度 第 一 抗 體第二抗體1：5001：1000 1:20001：40001：100+ (+)+ (+)+ ()+ (-)1：200+ (+)+ (-)+ (-)+ (-)1：400+ (-)+ (-)- -括號內(nèi)為背景染色結(jié)果 棋盤法：測定兩種以上抗體的最佳配合稀釋度 第 一 抗 體第二2.4 免疫組化染色對照的設(shè)計 免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對照，沒有對照的免疫組化結(jié)果是毫無意義的。對照的設(shè)置在于證明和肯定陽性結(jié)果的特異性，排除非特異性疑問。 主要是針對一抗的對照，包括陰性對照、陽性對照和自身對照。2.4 免疫組化染色對照的設(shè)計陰性對照空白對照：用PBS 代替第一抗體替代對照

10、：用正常血清代替第一抗體抑制對照：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加酶或熒光標(biāo)記的特異性抗體吸收實驗對照：將足量的抗原 (如SP)加入相應(yīng)的一抗 (抗SP血清)孵育、離心、取上清液作為第一抗體陰性對照陽性對照 用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時進行免疫組織化學(xué)染色，對照切片應(yīng)呈陽性自身對照 同一切片上，不同組織成分或不同部位或神經(jīng)核中的陽性或陰性結(jié)果與檢測的目的物對照比較。如應(yīng)為陽性的組織或部位是陽性，則免疫組化技術(shù)正確，如為陰性，則表明染色技術(shù)有問題或免疫試劑質(zhì)量有問題。陽性對照替代對照PVN中Fos表達替代對照PVN中Fos表達3、免疫組化正式實驗3.1 步驟組織固定冰凍切片阻斷內(nèi)源性酶封閉處

11、理一抗處理二抗處理顯色復(fù)染脫水透明封片3、免疫組化正式實驗3.1 步驟組織固定冰凍切片阻斷內(nèi)源性酶3.2 注意事項組織固定 保持細(xì)胞固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，保存組織細(xì)胞的抗原性固定液的選擇 ：免疫組化技術(shù)成功與否的基礎(chǔ)。不同抗原穩(wěn)定性各不相同，對固定液的耐受性差異較大?？勺鞫喾N固定液對比，從而選出理想的固定液。常用中性緩沖多聚甲醛液。另有Bouins液、Zanbonis液、Karnovskys液組織固定時間：最好在l2h內(nèi)，一般不應(yīng)超過24h。隨著固定時間的延長，組織抗原的檢出強度將逐漸降低 固定方法：浸入法和灌注法3.2 注意事項去除生物體自身含有的內(nèi)源性酶滅活堿 (酸)性磷酸酶：左旋咪唑 (24m

12、g/mL)加入底物液中并保持pH7.68.2能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，酸性磷酸酶可用0.05mol/L酒石酸抑制。去除內(nèi)源性過氧化物酶：0.33過氧化氫甲醇液孵育1030min。甲醇對各種酶，都有鈍化的作用。去除生物體自身含有的內(nèi)源性酶去除內(nèi)源性生物素 正常組織細(xì)胞中含有生物素，特別是肝、脾、腎、腦，皮膚等組織中，在應(yīng)用親和素試劑的染色中，內(nèi)源性生物素易結(jié)合卵白素，形成卵白素一生物素復(fù)合物，導(dǎo)致假陽性采用生物素方法染色前，將組織切片浸于0.01%卵白素溶液室溫處理20分鐘，使其結(jié)合位點飽和，以消除內(nèi)源性生物素的活性。去除內(nèi)源性生物素 合理地使用封閉試劑一抗孵育前，常常加入非免疫動物血清，以

13、減少背景的染色，因為抗體是高度的電荷分子，可能與帶有相應(yīng)電荷的組織成分非特異性地結(jié)合要消除電荷吸附所造成的非特異性背景染色，可用二抗動物的210%非免疫血清或12%牛血清白蛋白，以封閉吸附位點 合理地使用封閉試劑抗體的配制根據(jù)一次實驗所需的抗體量來決定配制的抗體量。配制抗體的微量取樣器一定要準(zhǔn)確，最好專用。根據(jù)抗體的使用說明書配制，一般可加去垢劑 如TritonX-100、 Tween-20等 一抗孵育可在4過夜，或室溫或37 幾小時抗體的配制PBS的沖洗沖洗的PBS為一次性，防止交叉污染溫柔沖洗，沖洗時間足夠，一般沖洗35次PBS的pH和離子強度的使用和要求 ，中性及弱堿性條件 (pH7-8

14、)有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強度則有利于分解PBS的沖洗顯色系統(tǒng)辣根過氧化物酶 (HRP)：DAB或AEC顯色DAB配制完后最長放置30 min，DAB顯色最長不宜超過10 min。增強顯色的方法：應(yīng)用金屬離子或有機復(fù)合物溶劑在顯色液中可增強DAB的顯色效果。包括銅、鋨、銀、鈷、鎳、及米唑等。加入1重金屬離子 (1：50)，可使顯色明顯增強，并發(fā)生變色反應(yīng)。以Ag、Co、Ni離子最好。顯色系統(tǒng)AEC顯色系統(tǒng)的鄙端是易溶于有機溶劑，封片以水性封片劑為主，染色切片不能久存。堿性磷酸酶 (AP)：最好選用NBT/BCIP，而AP-Red

15、、AP-Qrange、Fas-Red染色結(jié)果均不能長期保存 AEC顯色系統(tǒng)的鄙端是易溶于有機溶劑，封片以水性封片劑為主，3.3 非特異性染色的出現(xiàn)逐一查找原因是否有效地去除內(nèi)源性酶非免疫血清封閉是否正確一抗要合適，過高的濃度極易出現(xiàn)非特異性每步的沖洗是否干凈組織切片在操作過程中是否曾經(jīng)干涸 DAB配置、使用、濃度是否準(zhǔn)確檢測系統(tǒng)是否與組織內(nèi)源性蛋白有交叉反應(yīng)3.3 非特異性染色的出現(xiàn)逐一查找原因4、免疫組化陽性結(jié)果的統(tǒng)計Image-Pro Plus的主要用途是分析測量圖象照片中的黃色部分是免疫組化染色的陽性表達成分。處理目標(biāo)是通過測量圖片中黃色部分的黃度來反映相應(yīng)蛋白表達的的量4、免疫組化陽性結(jié)果的統(tǒng)計Image-Pro Plus的主要4.1 校正光密度圖片的光強單位與測量中的光密度單位的不一致 計算機圖片格式中，純黑的點的“亮度”為零，其灰度gray=0；純白點的“亮度”為255，其灰度gray=255 光密度OD值：為吸收光線物質(zhì)的光學(xué)密度4.1 校正光密度圖片的光強單位與測量中的光密度單位的不一致未校正前，IPP用的是gray灰度單位。淺色處灰度值大，深色處灰度值小光密度校正的目的就是讓照片上亮的、白的、染色淺的點的OD值顯示為接近于零的小的數(shù)值，讓暗的、黑的、染色深的陽性區(qū)域點的OD值顯示為較大的數(shù)值光密度分析