1、體外血小板活動(dòng)腔研究要領(lǐng)的創(chuàng)立和應(yīng)用thedevelpentandappliatinfaflhaberfrplateletresearhdepartentfbiengineering，beihanguniversity，beijing，100083，hina血小板外貌膜糖卵白glyprtein，gpib與受損血管內(nèi)皮外貌血管性假性血友病因子vnillebrandfatr，vf的結(jié)合是血小板血栓形成的起始步調(diào)。這一結(jié)合使得血小板與血管內(nèi)皮外貌產(chǎn)生瞬時(shí)的結(jié)合，并以轉(zhuǎn)動(dòng)的方法黏著于血管內(nèi)皮外貌，與此同時(shí)，啟動(dòng)血小板內(nèi)一系列的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，產(chǎn)生a2+濃度增長(zhǎng)，pi3k活化等反響1，使得血小板外貌整

2、合素b3活化2。b3與vf和血漿中纖維卵白原結(jié)合，終極使得血小板安穩(wěn)附著于血管外貌，并彼此聚攏成團(tuán)，形成血栓?？梢姡琯pib與vf的結(jié)合在血小板血栓形成中起著起始、關(guān)鍵的作用。這一歷程的研究對(duì)防范和治療血栓形成性疾病有著緊張代價(jià)。血小板和vf的彼此作用通常的研究要擁有：利用血小板聚攏儀檢測(cè)瑞斯托霉素ristetin誘導(dǎo)的血小板聚攏；流式細(xì)胞儀技能或elisa直接檢測(cè)血小板和vf的結(jié)合等。但這些要領(lǐng)很難反響體內(nèi)血管活動(dòng)條件下血小板與血管內(nèi)皮的直接彼此作用的及時(shí)環(huán)境。在本研究中，我們將vf包被于細(xì)玻璃管外貌以模擬血管受損的環(huán)境，同時(shí)別離利用負(fù)壓裝置、蠕動(dòng)泵和恒定注射泵以產(chǎn)生差異流態(tài)和準(zhǔn)確剪切率的流

3、體環(huán)境，樂(lè)成地創(chuàng)立了體外流體條件下血小板與vf彼此作用的流體模子，為血小板相干的底子研究，以及抗血小板相干的抗血栓藥物研究，提供了一種實(shí)在有用的研究要領(lǐng)。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1試劑和儀器1.2實(shí)行要領(lǐng)1.3活動(dòng)腔實(shí)行把包被了vf的玻璃管裝在倒置顯微鏡上，別離利用負(fù)壓裝置、蠕動(dòng)泵、恒定注射泵3種動(dòng)力體系，按照公式r=4qr3準(zhǔn)確盤算玻璃管中的剪切率4，使得血小板或h細(xì)胞懸液通過(guò)玻璃管。活動(dòng)起始后，顯微錄像體系表現(xiàn)并記載玻璃管中的環(huán)境。末了用difiedtyrdesbuffer在同樣剪切率調(diào)治下沖洗玻璃管5in，仍舊黏附的細(xì)胞即為激活了整合素b3的不變黏附。2效果血小板血栓的形成與血管中的血流環(huán)境嚴(yán)密

4、相干5。病理性剪切力能誘導(dǎo)血小板的黏附、聚攏6。有研究者接納平板活動(dòng)腔和錐板黏度計(jì)來(lái)模擬體內(nèi)血液活動(dòng)。我們接納細(xì)玻璃管簡(jiǎn)樸而直不雅的不雅察到活動(dòng)條件下血小板與vf結(jié)合的全歷程表示圖見圖1。gpb與vf的彼此作用使得血小板在vf外貌以轉(zhuǎn)動(dòng)的方法產(chǎn)生瞬時(shí)的黏附，同時(shí)啟動(dòng)血小板內(nèi)一系列細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，終極激活整合素b3導(dǎo)致血小板產(chǎn)生不變的黏附。圖1實(shí)行體系表示圖把包被了vf的玻璃管裝在倒置顯微鏡上，通過(guò)硅膠管毗連到提供動(dòng)力裝置，樣品別離在負(fù)壓裝置、蠕動(dòng)泵、恒定注射泵的發(fā)動(dòng)下游經(jīng)玻璃管，在流出口網(wǎng)絡(luò)樣品。同時(shí)通過(guò)d體系將圖像傳輸?shù)奖P算機(jī)，同步表現(xiàn)并錄像。3討論血小板發(fā)揮止血成效和產(chǎn)生血栓必要血小板黏

5、著到內(nèi)皮下基質(zhì)，而這一歷程是由血小板膜糖卵白ib與vf彼此作用所起始的。gpb與vf的結(jié)合誘導(dǎo)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)使得黏附的血小板被激活：a2+濃度的改變，卵白激酶、pi3k、卵白磷酸化酶和酪氨酸激酶等的活化，并產(chǎn)生血小板肌動(dòng)卵白的重新擺列8，活化整合素iib3介導(dǎo)更不變的黏附，致密顆粒開釋出內(nèi)容物誘導(dǎo)血小板聚攏。gpb與vf的結(jié)合是血小板發(fā)揮其成效的關(guān)鍵步調(diào)。我們所創(chuàng)立的要領(lǐng)可不雅察和記載特定剪切率條件下，血小板或轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生黏附的歷程。與通常利用的平行平板活動(dòng)腔和錐板黏度計(jì)比擬，我們的要擁有以下幾個(gè)長(zhǎng)處：1裝配簡(jiǎn)樸，剪切力不會(huì)由于裝配的偏向而產(chǎn)生影響。平行平板活動(dòng)腔提供的剪切力與上下平板

6、間間隔的平方成反比，裝配時(shí)的偏向會(huì)對(duì)盤算剪切力帶來(lái)較大的影響。而錐板黏度計(jì)的錐尖由于恒久利用會(huì)產(chǎn)生磨損，改變了錐體與平板間原有的角度，如許所產(chǎn)生的剪切力將不再是同等的。我們的要領(lǐng)不存在裝配偏向?qū)羟辛Φ挠绊憽?樣品利用量小，節(jié)省了樣本。3便于不雅察。由于玻璃管是透明的，我們?cè)诠鈱W(xué)顯微鏡下就能明晰地不雅察到血小板懸液活動(dòng)和黏附的環(huán)境。我們的體系也可以對(duì)血小板或細(xì)胞舉行熒光染色不雅察。而如今還沒(méi)有商品化的可視化的錐板黏度計(jì)，必要實(shí)行室本身加工。4外貌處置懲罰簡(jiǎn)樸。當(dāng)我們研究剪切力對(duì)血小板直接作用的機(jī)制時(shí)，必需消除血小板外貌同實(shí)行體系間的彼此作用。利用錐板黏度計(jì)時(shí)通常接納硅油或別的非血栓形成質(zhì)料外貌來(lái)消除這些彼此作用。而利用玻璃管只必要接納bsa關(guān)閉就可以到達(dá)要求，操縱簡(jiǎn)樸又便利。我們的要領(lǐng)也存在一些缺點(diǎn)。當(dāng)負(fù)壓體系提供動(dòng)力時(shí)，是由于虹吸原理把細(xì)胞懸液吸入到玻璃管中，可在此歷程中，水柱的液面高度差漸漸縮小，使得流速遲鈍地產(chǎn)生改變。蠕動(dòng)泵是在活動(dòng)腔技能中普及接納的，但是產(chǎn)生的是正弦活動(dòng)，這與我們盼望的不變恒流差異。注射泵流速不變，但不克不及創(chuàng)立循環(huán)的活動(dòng)體系，由于血小板黏附反響時(shí)間較短，以是利用注射泵完全可以或許滿意要求。本體系除了可以