1、病毒感染實驗診斷第1頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五然后根據(jù)可疑病毒的生物學特點、機體免疫應答和臨床過程，以及病人當前所處的時機，確定實驗診斷方法。第2頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五1.對潛伏期短，發(fā)病時尚無抗體產(chǎn) 生，可選擇測定病毒顆粒、病毒 抗原或核酸。第3頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五2.對潛伏期超過十天的感染，可 檢測特異性的IgM抗體來進行早 期快速診斷，及區(qū)別初次和再 次感染。第4頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五3.對可在體內(nèi)形成持續(xù)感染或潛伏 感染的病毒，可檢測急性期和恢 復期雙份

2、血清的IgG抗體有無4倍 以上升高，或直接檢測病毒核酸。第5頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五4.對原因不明或有新病毒感染時， 應采集標本進行病毒分離，同 時應采取雙份血清以確認分離 的病毒為病原體。第6頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五5.對同一癥狀可有多種病毒引起的 情況，應同時檢測幾種相關病毒 的病毒顆粒、抗原或抗體，6.對由多個型別組成的病毒可測定 它們的共同抗原。 第7頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五第一節(jié)標本采集與運送 一、標本的采集1.采樣時間 盡可能在發(fā)病的初期， 急性期或患者人院的當天進行。 第8頁，共63頁

3、，2022年，5月20日，8點40分，星期五2.標本種類的選擇 根據(jù)臨床感染 的癥狀及流行病學資料，判斷可 能感染病毒種類，選擇相應部位 采取標本。 第9頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五常見分離病毒標本的選擇 病毒咽拭子糞便血液腦脊液唾液 組織 柯薩奇A和B組 +心 單純皰疹病毒 +腦膜 腮腺炎病毒 +流感病毒 +輪狀病毒 +HAV+HIV+ 精液第10頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五3常見標本的采集方法 (1)血液：以無菌取抗凝血10ml。 抗凝選用100nml肝素鈉。 用于分離CMV、HSV，、黃病 毒、EBV、HIV-1及新生兒腸 道病毒。

4、第11頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五(2)腦脊液：以無菌取腦脊液 12ml，冰浴立即送檢。 在4可存放72h。用于分 離柯薩奇病毒、ECHO病毒、 腸道病毒、腮腺炎病毒。第12頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五(3)宮頸或陰道拭子：采取病灶部 位分泌物，或將拭子伸人宮頸 約lcm停留5秒取出，冰浴立即 送檢。用于分離 HSV、CMV。第13頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五(4)糞便標本：取24糞便加 10ml運送液立即送檢，用于 分離腺病毒、腸道病毒和輪 狀病毒。第14頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期

5、五(5)含漱液：用無菌生理鹽水讓 患者含漱。用于分離流感病 毒、副流感病毒、鼻病毒、 RSV等。 第15頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五(6)喉拭子：用壓舌板避免唾液 污染，用拭子采取咽喉部表 面。用于分離腺病毒、CMV、 腸道病毒、HSV、流感病毒等。第16頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五(7)尿道拭子及尿液標本：尿道拭 子伸人尿道4cm轉動3次，以獲 得較多的上皮細胞，用于分離 CMV和HSV。(8)尸檢標本：死亡后盡早采集各 種器官，分別使用器械和容器。 第17頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五二、標本的運送和保存病毒

6、抵抗力弱，室溫中容易滅活，用于分離培養(yǎng)的標本要盡快送檢，4下數(shù)或-70。凍存液中加入甘油或二甲基亞砜(DMSO)等作保護。第18頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五病毒傳送培養(yǎng)基以Hanks液為基礎加滅活的小牛血清。為抑制細菌生長加青霉素100Uml和鏈霉素100gml，為了抑制真菌的生長加入25gml二性霉素B或40gml制霉菌素。 第19頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五第二節(jié) 病毒分離與鑒定 一、病毒的分離方法1.組織細胞培養(yǎng) 根據(jù)細胞的來源、 特性和傳代次數(shù)分為：(1)原代細胞培養(yǎng)：將細胞懸液。 加入營養(yǎng)液培養(yǎng)。形成的單 層細胞，稱之為原代細胞

7、。 第20頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五(2)二倍體細胞株：仍保持二倍體 特性。壽命一般為4050代， 如人胚肺細胞。廣泛用于病毒 分離和疫苗制備。第21頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五(3)傳代細胞系：來于腫瘤細胞， 染色體特征類似腫瘤細胞。 常用的有人宮頸癌細胞(Hela)、 人喉上皮癌細胞(Hep-2)。第22頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五2雞胚接種 雞胚是用于分離粘 病毒科、皰疹病毒、痘類病毒 的較為理想的材料。 第23頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五3動物接種 動物對病毒的敏感 性是不

8、同的，選擇合適動物十 分重要。小鼠、乳鼠、家兔、 豚鼠、猴等常用于分離病毒。 第24頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五常用于病毒分離的細胞 細胞種類可分離的病毒 原代細胞 非洲綠猴腎細胞 人單核細胞 人胚腎、肺細胞 恒河猴獼猴腎細胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、風疹病毒 HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒、腺病毒ECHO、脊髓灰質炎病毒、柯薩奇A、B組、RSV 二倍體細胞株 人胚肺成纖維細胞株 WI-38、MRC5 CMV、VZV、鼻病毒腮腺炎病毒、腺病毒 傳代細胞系 Hela Hep-2 Vero 柯薩奇A、B組、RSV腺病毒、RSVHSV、RSV、風疹病毒

9、、輪狀病毒、麻疹病毒第25頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五三、病毒的鑒定 必須通過全面了解其特性才能得到鑒定。1.根據(jù)臨床特點，流行病學資 料，標本來源，大致了解病 毒的一些特性，有助于確認 病毒的種類。第26頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五2.動物感染范圍及特點 病毒感 染動物的范圍、發(fā)病的潛伏期。3.細胞培養(yǎng)特點。 綜合上述資料作出鑒定。第27頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五病毒鑒定的方法1.細胞培養(yǎng)的結果觀察 病毒增殖后導致細胞發(fā)生:細胞病 變效應(CPE)。細胞腫大，變圓堆積 成葡萄狀，細胞溶解出現(xiàn)空斑，細胞 融合

10、形成多核巨細胞，胞漿內(nèi)或核內(nèi) 出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性包涵體等；第28頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五不出現(xiàn)細胞病變現(xiàn)象。細胞培養(yǎng)液pH的變化。 第29頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五2.中和試驗病毒與特異性抗體進行免疫反應，使病毒失去感染性，在細胞培養(yǎng)和活的機體內(nèi)不出現(xiàn)病變的試驗。常用細胞培養(yǎng)進行中和試驗。如果特異性抗體能中和病毒，使之失去感染性，不出現(xiàn)細胞病變效應，則該病毒為特異性抗體的同型病毒，第30頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五用于病毒的分型診斷最具敏感和準確性。也可用于檢查患者病后或人工免疫后，機體血清中抗體增加情況

11、。 第31頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五3.空斑或蝕斑形成試驗 空斑是指在單層細胞中被病毒感染引 起死亡的細胞區(qū)域，周圍被活細胞包 圍。一般而言，一個空斑是由一個感染 性病毒顆粒感染所引起的。不同的病毒 引起的空斑形態(tài)和大小不同?？蛇M行病 毒顆粒的計數(shù)、純化，結合中和試驗可 進行病毒的鑒定。第32頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五4.干擾現(xiàn)象 某些病毒間存在著干擾現(xiàn)象， 如某些型別的鼻病毒能干擾 以后進入的副流感病毒的增 殖，從而阻抑后者的紅細胞 吸附作用。第33頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五5.紅細胞吸附及吸附抑制試驗

12、正粘病毒，副粘病毒感染的宿主細胞，病毒增殖后產(chǎn)生細胞病變，但在細胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附雞、豚鼠或猴紅細胞。第34頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五可作為初步鑒定。如果在培養(yǎng)瓶中加入相應的血凝素抗血清后，不出現(xiàn)紅細胞吸附現(xiàn)象，是為紅細胞吸附抑制試驗陽性，可作為病毒鑒定的依據(jù)。第35頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五4血凝試驗及血凝抑制試驗 某些病毒可與一定種類的哺乳 動物或禽類的紅細胞產(chǎn)生血凝 現(xiàn)象。加入相應的血凝素抗體 可抑制血凝現(xiàn)象的發(fā)生，是為 血凝抑制試驗?？勺鳛椴《拘?別確定的依據(jù)。第36頁，共63頁，2022年，5月20

13、日，8點40分，星期五5病毒的大小及形態(tài) 可用電子顯微鏡觀察病毒的 大小及形態(tài)。第37頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五6核酸類型鑒別及序列測定 利用5溴-2-脫氧尿苷(BUDR)抑 制DNA復制的特性，在細胞培養(yǎng)液中 加入該物質，可抑制DNA病毒的復制 和增殖，抑制細胞病變的出現(xiàn)，但對 RNA病毒無抑制作用，以此判斷病毒 核酸類型。第38頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五對病毒核酸特異序列或全序列的堿基排列測定或 DNA雜交、DNA-RNA雜交來鑒定病毒。第39頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五 7耐酸試驗 腸道病毒對酸有耐受

14、力，而 鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。 第40頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五8乙醚敏感試驗 病毒外圍如有類脂包膜，則易 被乙醚破壞，而失去感染性，不 能感染細胞?？勺鳛椴《臼欠窬?有類脂包膜的依據(jù)，也可用氯仿 或去膽酸鈉代替乙醚進行試驗。 第41頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五9免疫熒光抗體染色 將感染細胞固定，用特異抗血 清熒光標記染色，在熒光顯微鏡 下，可見細胞內(nèi)熒光，即可確定 型別。 第42頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五第三節(jié)病毒感染快速診斷通過測定病毒的特異標志成分，如特殊形態(tài)、特異的抗原成分及病毒的核酸，早期確

15、認病毒的感染，是病毒學診斷的重大發(fā)展。 第43頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五一、形態(tài)學檢查1光學顯微鏡 觀察病毒感染細胞出現(xiàn)的包涵體。 根據(jù)特點可作出輔助診斷?？袢?病毒在腦細胞出現(xiàn)嗜酸性的圓形或 橢圓形包涵體，稱為內(nèi)基小體。巨 細胞病毒在上皮細胞的細胞核內(nèi)出 現(xiàn)周圍繞有一輪暈似“貓頭鷹眼”樣 大型嗜酸性包涵體。第44頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五2電子顯微鏡檢查 (1)電鏡直接檢查：早期病毒感染標 本的病毒顆粒。如“秋季瀉”患兒 糞便中的輪狀病毒、甲肝患者糞 便中的HAV，皰疹病毒的皰疹液， HBV患者血清，均可觀察到特征性 病毒顆粒。

16、第45頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五(2)免疫電鏡檢查：在標本中加入 抗體。使病毒聚集成塊負染觀 察，更易發(fā)現(xiàn)病毒體，靈敏度 可提高100倍。第46頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五 二、病毒抗原檢測 病毒抗原是病毒特異性的標志， 通過免疫學技術檢測標本中特 異性抗原存在，可以早期診斷 病毒感染。第47頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五1免疫熒光技術 適合于型別少， 細胞培養(yǎng)難以成功的病毒，如流 感病毒、副流感病毒、皰疹病毒、 巨細胞病毒、腺病毒等。肝活檢 組織中的肝炎病毒、神經(jīng)組織中 的單純皰疹病毒、腦組織中的狂 犬病毒或

17、其他脫落細胞和活檢組 織中的病毒抗原檢測。第48頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五2酶免疫技術 有酶免疫組化和 酶免疫吸附(ELlSA)試驗法。測 定標本中游離的抗原或抗體。 如檢測乙型肝炎病毒的表面抗 原(HBsAg)，HIV感染病人的P24 抗體等。第49頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五3.其他技術 如固相放射免疫技術、 發(fā)光免疫分析技術、膠體金標記 的免疫層析技術等。第50頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五三、早期抗體檢測 檢測病毒感染機體后產(chǎn)生的早期特異性抗體，如測定特異性IgM可以快速明確診斷各種病毒引起的新生兒先天

18、性感染，測定HAV感染后抗HAV的IgM抗體可以明確診斷HA等。第51頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五四、病毒核酸檢測 只要有完整的特異基因片段存在， 就可進行診斷。第52頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五1斑點雜交法 將待測的DNA或RNA直接點在雜交濾膜上，變性后，用標記的核酸探針進行雜交。用32p或131I同位素標記的探針通過放射白顯影，可直接觀察?，F(xiàn)用地高辛、生物素等非同位素物質標記，然后采用酶反應或酶免疫技術進行檢測，已被越來越多的實驗室廣泛使用。第53頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五2固相雜交技術 將核酸探針包被

19、聚苯乙烯微孔 板中，加人待測的核酸序列和 標記的指示探針雜交液中進行 雜交，洗滌后，用酶免疫技術 進行檢測。第54頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五3.原位分子雜交技術 在細胞原位暴露DNA或RNA，加入標記特異核酸探針進行雜交。通過顯色技術可顯示特定雜交探針在細胞內(nèi)的位置和核酸的數(shù)量。第55頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五4.Southern印跡和Northern印跡法 Southern印跡法用于DNA的雜交。提取 DNA,用內(nèi)切酶切割后，進行瓊脂糖電泳 按分子量使DNA分開，將DNA移至硝酸纖 維膜上，用標記探針進行雜交?？梢詸z 測病毒DNA特異序列。 Northern印跡法用于RNA雜交分析。將 瓊脂糖電泳后的RNA移至DBM膜上，用標 記探針進行雜交。用于檢測RNA或mRNA。第56頁，共63頁，2022年，5月20日，8點40分，星期五 5聚合酶鏈反應(PCR) 選擇病毒的特異保守片段作為靶基因，進行引物設計和擴增可診斷病毒性感染。選擇病毒的易變區(qū)，結合RFLP，測序等技術可以對病毒進行分型和突變的研究。第57頁，共63