1、免疫學診斷與防治海南醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室制作Copyright 2009免疫學診斷與防治海南醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室制作Copy免疫學診斷 一、抗原或抗體的檢測二、淋巴細胞的測定三、免疫學檢測方法的應用免疫學診斷 一、抗原 （一）抗原抗體反應的原理免疫學診斷一、抗原或抗體的檢測1、抗原抗體反應的 特異性（1）特異性（2）可逆性 親和力（affimity）與親合力（avidity） 抗體抗原之間的結合力大小。 結合力大則親和力強 ，不易解離，反之則然。 （3）適宜的條件2、抗原抗體反應的可見性 抗原抗體按適當比例結合，形成肉眼可見的現(xiàn)象。 （一）抗原抗體反應的原理免疫學診斷一、抗原或

2、抗體的檢測1應 用1、利用已知抗原檢測未知抗體（1）檢測病原微生物的相應抗體以輔助診斷疾?。?傷寒病、流行性乙型腦炎、AIDS病等。（2）檢測自身抗體診斷自身免疫?。篠LE、類風濕性關節(jié)炎等2、利用已知抗體檢測未知抗原（1）鑒定病原菌：診斷疾病（2）檢測腫瘤相關抗原：檢測甲胎蛋白以診斷肝癌（3）檢測血型抗原、HLA抗原：鑒定血型，親子鑒定（4）檢測藥物半抗原： 確認運動員是否服用興奮劑應 用1、利用已知抗原檢測未知抗體（1）檢測病原微生物（二） 抗原或抗體的檢測方法 凝集反應沉淀反應補體參與的抗原抗體反應免疫標記技術（二） 抗原或抗體的檢測方法 凝集反應 （一）凝集反應（agglutinati

3、on） 顆粒性抗原（紅細胞、細菌、 乳膠顆粒等）與抗體特異性結合，形成肉眼可見的凝集塊。1 、直接凝集(direct agglutination) 玻片凝集、試管凝集2、間接凝集（indirect agglutination） 可溶性抗原包被在乳膠顆?；蚣t細胞表面，與相應 抗 體混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。3、抗球蛋白試驗（Coombs試驗） 抗原與單價抗體（不完全抗體）結合不出現(xiàn)凝集塊，再加入抗球蛋白后即形成凝集塊。 用于檢測抗Rh抗體以診斷新生兒溶血性貧血。 （一）凝集反應（agglutination） 直接凝集直接凝集乳膠顆粒紅細胞類風濕因子檢測妊娠試驗間接凝集直接凝集乳膠顆粒紅細胞類風濕因子檢

4、測間接凝集直接凝集（二）沉淀反應（precipitation）1、單向免疫擴散（single immunodiffusion）：常用于測定IgG、IgM、IgA、C3、C4等。 可溶性抗原（免疫球蛋白、細胞裂解物、組織浸液等）與相應抗體結合， 形成不溶性免疫復合物，出現(xiàn)不透明的沉淀物。多在半固體瓊脂凝膠上進行，形成白色的沉淀。沉淀環(huán)抗體混于瓊脂凝膠中制板環(huán)的直徑與抗原含量成正相關（二）沉淀反應（precipitation）1、單向免疫擴散2、雙向免疫擴散（doule immunodiffusion）：常用于抗原或抗體的定性檢測、組成和兩種抗原相關性分析。一致部分一致不一致，有多種成分2、雙向免

5、疫擴散（doule immunodiffusion3、免疫電泳（immunoelectrophoresis）常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。如骨髓瘤及性聯(lián)低丙種球蛋白血癥的診斷3、免疫電泳（immunoelectrophoresis）常4、免疫比濁法（immunonephelomtry）：快速簡便。用于血清IgG、IgA、IgM、 補體C3、C4含量測定4、免疫比濁法（immunonephelomtry）：快速簡 （三）補體參與的抗原抗體反應1、50 %補體溶血試驗（CH50測定） 血清總補體量測定2、補體結合試驗(complement fixation test)：檢測抗

6、原或抗體。原理：用已知的指示系統(tǒng)檢測試驗系統(tǒng)是否結合補體進行診斷試驗原理？檢測系統(tǒng)：待測樣品和已知抗原（或抗體）指示系統(tǒng)：SRBC和溶血素溶血陰性；不溶血陽性補體 （三）補體參與的抗原抗體反應1、50 %補體溶血試驗（CH 用標記物標記抗體或抗原進行抗原抗體反應借以提高免疫學診斷的敏感性熒光素 ：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）、藻紅蛋白、 羅丹明（紅色熒光）放射性同位素： 125I、131I酶：辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶免疫熒光檢測法（IFA）放射免疫檢測法（RIA）酶免疫檢測法（EIA） （四）免疫標記技術液相（ELISA）、固相（免疫組化技術） 用標記物標記抗體或抗原進行抗原抗體反應借以提直

7、接熒光法間接熒光法直接熒光法間接熒光法間接ELISA雙抗夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA法）間接ELISA雙抗夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme li BAS-ELISA法（ biotin-avidin-system，生物素-抗生物素系統(tǒng)-ELISA法）：敏感性更高。用于抗原抗體以及DNA、RNA的檢測。卵白及某些微生物中的蛋白質 BAS-ELISA法（ biotin-avidin 抗細胞因子的抗體包被（1）（2）（3）（4）抗原包被用于效應細胞分泌的單一細胞因子的測定，也可測定分泌特異抗體的B細胞的頻數。 抗細胞因子的

8、抗體包被（1）（2）（3）（4）抗原包被用于效放射免疫檢測法（RIA）：靈敏度達pg水平。常用于微量物質測定，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛等藥物以及IgE等。放射免疫檢測法（RIA）：靈敏度達pg水平。常用于微量物質測能分離分子大小不同的蛋白質并確定其分子量，常用于檢測多種病毒的抗體或抗原，如抗HIV抗體的檢測。能分離分子大小不同的蛋白質并確定其分子量，常用于檢測多種病毒 二、淋巴細胞的測定（一）淋巴細胞的分離與類型鑒定1、淋巴細胞的分離：外周血葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法白膜層單核細胞淋巴細胞BT吸附分離過尼龍毛柱分離 二、淋巴細胞的測定（一）淋巴細胞的分離與類型

9、鑒定1、淋（1）間接免疫熒光法：鑒定細胞的群、亞群。用CD3、CD4、CD8單克隆抗體檢測患者外周血T細胞表面相應抗原CD3+ T細胞，計算T細胞總數。 CD4+ CD4+T細胞，計算CD4+T細胞數。 CD8+CD8+ T細胞，計算 CD8+亞群T細胞數 計算CD4+ / CD8+比例 正常人PMB中T細胞占6575% CD4+ / CD8+約為1.52（3）流式細胞術（flow cytometry）2、淋巴細胞的類型鑒定：淋巴細胞表面標記檢測、 記數用mIgM、mIgD單克隆抗體檢測患者外周血B細胞表面相應的抗原已檢測B細胞的數量（2）磁珠分離法：用抗CD4交聯(lián)的微珠可將T細胞 中的CD4

10、+T細胞與CD8+T細胞分開。正常人外周血中SmIg+ 細胞占812%（1）間接免疫熒光法：鑒定細胞的群、亞群。用CD3、CD4、流式細胞儀流式細胞儀免疫學診斷與防治課件免疫學診斷與防治課件免疫學診斷與防治課件 （二）淋巴細胞功能測定1、T細胞功能測定（1）T細胞增殖試驗（淋轉）：絲裂原、抗CD3單克隆抗體 等能非特異地激活T細胞，使之發(fā)生轉化增殖，計算淋 巴母細胞轉化率（正常值6580%） 。 形態(tài)學觀察法 3H-TdR滲入法：用液體閃爍儀測定樣品的射線放射活性 MTT法（2）淋巴細胞介導的細胞毒試驗（LMC） 檢測CTL、NK、 LAK、TIL細胞殺傷靶細胞的功能 （二）淋巴細胞功能測定1

11、、T細胞功能測定（1）T細胞增殖試51Cr釋放法 凋亡細胞檢查法：TUNEL法（TdT dependent dUTP-biotin nick end labeling）、FACS測定法（3）細胞因子檢測：鑒定分離的淋巴細胞亞群，監(jiān)測某些疾病狀態(tài)的細胞免疫功能。IL-2、IL-2R、rIFN 、TNF等檢測ELISA法 生物活性測定法 聚合酶鏈反應（PCR）法51Cr釋放法（3）細胞因子檢測：鑒定分離的淋巴細胞亞群， （2）抗體形成細胞測定 溶血空斑試驗 （hemolytic forming cell assay，HFC）計算HFU/ml2、B細胞功能測定（1）B細胞增殖試驗：LPS、SPA刺激

12、，檢查抗體形成細胞 的數目（3）ELISPOT法檢查特異抗體形成細胞 （2）抗體形成細胞測定 溶血空斑試驗 2、B細3、體內免疫細胞功能測定：皮膚試驗（1）遲發(fā)型超敏反應：舊結核菌素試驗（ OT試驗 ） 皮試（+）有一定的細胞免疫能力 皮試（）細胞免疫功能缺損（2）速發(fā)型超敏反應：青霉素皮試、 異種血清皮試3、體內免疫細胞功能測定：皮膚試驗（1）遲發(fā)型超敏反應：舊結免疫治療(immunotherapy) 針對機體低下或亢進的免疫狀態(tài)，人為地增強或抑制機體的免疫功能 以達到治療疾病的治療方法稱之。免疫調節(jié)（immunomodulation） 利用物理、化學和生物學的手段來調節(jié)機體的免疫功能，使原

13、有的免疫功能增強或減弱。免疫重建(immunoreconstitution) 將免疫功能正常個體的造血干細胞或淋巴細胞移植給患有免疫功能缺陷的個體，使后者的免疫功能全部或部分得到恢復。免疫治療(immunotherapy) 針對 分類一、免疫增強療法和免疫抑制療法三、主動免疫治療（active immunotherapy）和被動免疫治療（passive immunotherapy）二、特異性免疫治療和非特異性免疫治療 分類一、免疫增強療法和免疫抑制抗體為基礎的免疫治療一、免疫血清1、抗毒素血清：用于治療和緊急預防外毒素所致的疾病，如白喉抗毒素、破傷風抗毒素。2、胎盤（丙種）球蛋白：用于被動預防

14、傳染病、治療丙種球蛋白缺乏癥。3、抗菌免疫血清：效果不顯著4、抗病毒免疫血清：預防病毒感染5、抗淋巴細胞丙種球蛋白：抑制淋巴細胞。用于防止器官移植排斥反應及自身免疫性疾病的治療?？贵w為基礎的免疫治療一、免疫血清1、抗毒素血清：用于治療和緊二、單克隆抗體（mAb）1、抗細胞表面分子的單克隆抗體：抗CD3單抗可用于治 療急性移植排斥反應，防止GVHD的發(fā)生2、抗細胞因子的單克隆抗體：抗IL-1、抗TNF單抗可減 輕炎癥反應，用于治療類風濕性關節(jié)炎等慢性炎癥 性疾病。3、抗體導向藥物治療（靶向治療）：用特異性單抗作為 載體裝載化學藥物（阿霉素、氨甲蝶呤等）、毒素 （蓖麻毒素等植物毒素、白喉毒素等細菌

15、毒素）、同位 素（131I、125I、111In）等細胞毒性物質，將其靶向性地 攜至腫瘤病灶局部，可較特異性地殺傷腫瘤，減少副作用。二、單克隆抗體（mAb）1、抗細胞表面分子的單克隆抗體：抗C三、基因工程抗體：降低抗體的免疫原性1、嵌合抗體（chimeric antibody）2、人源化抗體3、完全人源化抗體4、單鏈抗體、雙價抗體、雙特異性抗體三、基因工程抗體：降低抗體的免疫原性1、嵌合抗體（chime抗原為基礎的免疫治療1、抗原以表位的形式進行免疫治療：將表位多肽與載體結合作為疫苗2、抗原以分子或片段的形式進行免疫治療：表面抗原疫苗、核酸疫苗或DNA疫苗、瘤苗（活瘤苗、減毒或滅活的瘤苗、異構

16、的瘤苗、基因修飾的瘤苗、抗獨特型抗體瘤苗、分子瘤苗等。疫苗抗原為基礎的免疫治療1、抗原以表位的形式進行免疫治療：將表位細胞因子及其拮抗劑為基礎的免疫治療1、細胞因子補充和添加療法：重組的細胞因子作為免疫應答調變劑（BRM）治療腫瘤、感染、造血障礙等。如干擾素、IL-2、TNF、CSF、EPO等2、細胞因子阻斷和拮抗療法：治療自身免疫性疾病、移植排斥、感染性休克等。如TNF單抗、IL-1R拮抗劑等。3、細胞因子基因療法：細胞因子基因轉染技術細胞因子及其拮抗劑為基礎的免疫治療1、細胞因子補充和添加療法細胞為基礎的免疫治療1、骨髓移植（1）自體骨髓移植（2）異體骨髓移植（3）臍血干細胞移植2、免疫效

17、應細胞（1）同種淋巴細胞被動轉移：注意配型（2）自體免疫效應細胞過繼免疫療法細胞為基礎的免疫治療1、骨髓移植2、免疫效應細胞LAK（lymphokine activated killer cells）細胞淋巴因子活化的殺傷細胞。是將外周血淋巴細胞在體外經過IL-2培養(yǎng)后誘導產生的一種新型的殺傷細胞，具有更強的殺瘤特性。其殺傷腫瘤細胞不需抗原致敏且無MHC限制性。主要為NK細胞TIL(tumorinfiltrating lymphocytes)細胞腫瘤侵潤淋巴細胞。是從實體瘤組織中分離得到的，經體外IL-2培養(yǎng)后獲得比LAK細胞更強的殺傷活性。CIK（cytokin inductive kill

18、er cells）細胞因子誘導的殺傷細胞。是以抗CD3mAb活化，并以IL-2、TNF-及TNF-等組合的細胞因子。支持外周血單個核細胞增殖并分化為CD3+CD56+殺傷細胞，具有比LAK更強的殺傷活性。LAK（lymphokine activated kille（一）免疫增強劑化學制劑：1、左旋咪唑 2、西咪替丁 微生物制劑：1、卡介苗（BCG） 2、短小棒狀桿菌 3、微生物提取物 中藥制劑： 黃芪、人參、枸杞子等免疫增強劑與免疫抑制劑免疫因子：1、轉移因子 2、免疫核糖核酸 3、胸腺肽（一）免疫增強劑化學制劑：1、左旋咪唑 微生物制劑：1 免疫增強藥物的適應癥和副作用 適應癥：免疫功能低下

19、的患者 （1）惡性腫瘤 （2）免疫缺陷病 （3）傳染病副作用：較輕 免疫增強藥物的適應癥和副作用 適應癥：免疫功能低下的患者 二、 免疫抑制劑化學制劑 1、烷化劑：環(huán)磷酰胺 2、抗代謝藥：激素：糖皮質激素 真菌代謝產物 1、 環(huán)孢素A：對T，尤其是TH有較好的選擇 性抑制作用 2、FK-506： 其作用強于環(huán)孢素A10-100倍， 且與環(huán)孢素A有明 顯的協(xié)同作用。 中藥及其有效成分 雷公藤多甙 二、 免疫抑制劑化學制劑 免疫抑制藥物的適應癥和副作用 適應癥：免疫功能過高引起機體損害的患者 1、抗移植排斥 2、超敏反應性疾?。杭に?3、自身免疫?。杭に亍⒗坠俣噙?4、感染性炎癥：激素副作用：明

20、顯 主要是骨髓抑制、肝腎毒性等 其抑制作用是非特異性的 長期應用可導致：繼發(fā)性免疫缺陷 嚴重感染 腫瘤 免疫抑制藥物的適應癥和副作用 適應癥：免疫功能過高引起機體免疫預防免疫預防疫苗 應用微生物制備的具有免疫原性的物質。包括滅活疫苗（死疫苗）和減毒活疫苗。如 麻疹疫苗，脊髓灰質炎疫苗，乙肝疫苗等。類毒素將細菌毒素用甲醛減毒后制備的具有免疫 原性的物質。如喉類毒素，破傷風類毒素。（二）人工被動免疫（ artificial passive immunization ）是給人體注射含特異性抗體的免疫血清或細胞因子等制劑，以治療或緊急預防感染的措施。如抗毒素、人免疫球蛋白制劑、細胞因子制劑、單抗制劑等。（一）人工主動免疫（artificial active immunization）用疫苗、類毒素接種機體，使之產生特異性的免疫，從而預防感染的措施。一、人工免疫（三）計劃免疫疫苗 應用微生物制備的具有免疫原性的物質。包括滅活疫苗（Production of an attenuated organismPathogenic virusIsolate virulence geneDelete virulence geneMutate virulence gene減毒活疫苗Production of an attenuated orProduction of a toxoid from