1、細(xì)胞培育：從活的機體中取出組織或細(xì)胞，分別成單個細(xì)胞，模擬機體內(nèi)的生長條件，在體外成立無菌、適平易必然營養(yǎng)條件等，使其在體外環(huán)境中連續(xù)生長生殖的過程，并保持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。凈化工作間設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)為萬級消毒：殺死病原微生物，但不用然能殺死細(xì)菌芽孢的方法，平時用化學(xué)的方法來達到消毒的作用，用于消毒的化學(xué)藥物叫做消毒劑。滅菌：把物理上全部的微生物全部殺死的方法，平時用物理的方法來到達滅菌的目的。貼壁依賴型細(xì)胞分為4型：成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、游走細(xì)胞型、多型細(xì)胞型傳代培育：體外生長的培育細(xì)胞受營養(yǎng)條件、生長空間等因素的限制，當(dāng)細(xì)胞增殖達到必然密度后，則需要分別出一部分細(xì)胞和更新培育液進行擴大培育的

2、過程。細(xì)胞活力：活細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融細(xì)胞凍存常用保護劑為DMSO，它是一種浸透性保護劑細(xì)胞污染和檢測方法：肉眼直接察見解、培育檢查法、顯微鏡察見解、PCR檢測支原體污染的辦理：用MRA辦理細(xì)胞、沖刷純化法、藥物輔助加溫辦理、使用支原體特異性血清原代培育：從體內(nèi)取出組織接種培育到第一次傳代階段，完成了從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的過渡和適應(yīng)過程，恢復(fù)了分裂增殖和生長發(fā)育的能力實體組織形成細(xì)胞懸液的方法：機械分別法、消化分別法（上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞）、貼塊培育法（血管圓滑肌細(xì)胞）懸浮細(xì)胞分別方法（淋巴細(xì)胞）：密度梯度離心原代細(xì)胞的純化：自然純化和人工純化（酶消化法、屢次貼壁法、培育

3、及限制方法、流式分選）動物細(xì)胞大規(guī)模培育方式：分批式培育、流加式培育、半連續(xù)式培育、連續(xù)式培育流式細(xì)胞術(shù)：高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或顆粒，測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強度，從而對細(xì)胞進行迅速多參數(shù)定性或定量檢測和分選的一種細(xì)胞解析技術(shù)。流式細(xì)胞儀：以流式細(xì)胞術(shù)為理論基礎(chǔ)，是集流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程學(xué)、單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)和計算機等學(xué)科知識為一體的高科技細(xì)胞解析儀。流式細(xì)胞儀特點：單個細(xì)胞解析、同時多參數(shù)解析、速度快（10000個/S）、統(tǒng)計學(xué)意義（供應(yīng)細(xì)胞集體的均值和分布情況）、分選感興趣的細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)比較的設(shè)置：空白比較（自覺熒光/本底熒光）：未染

4、色細(xì)胞同型/獨到型比較：抗原抗體之間可否特異性結(jié)合，消除非特異結(jié)合補償比較：多色解析時做每種熒光素單獨染色的細(xì)胞陽性比較：確定操作過程的正確性熒光補償：利用電子技術(shù)活計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除的技術(shù)流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示方式：單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)二維點圖、等高線圖、密度圖細(xì)胞增殖檢測技術(shù)：直接計數(shù)：優(yōu)點：不需要特定的試劑和儀器、正確。弊端：不適合樣品數(shù)量多的情況、不適合評估特定的亞群胸腺嘧啶核苷摻入法（3HTdR）：優(yōu)點：敏感性高、客觀性好、重復(fù)性好。弊端：但需要必然設(shè)備條件，存在放射性核素污染的問題溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）檢測法：優(yōu)點：不但能用于體外實驗，還能夠用于活體

5、實驗。弊端：Brdu需要變性DNA后才能與抗體結(jié)合，破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響其他染料結(jié)合染色，以致染色彌散，正確性降低等問題羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法：進入細(xì)胞后不可以逆地與氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上，當(dāng)細(xì)胞分裂時，CFSE標(biāo)志熒光可平均分配至兩個子代細(xì)胞，其熒光強度是親代的一半，在一個增殖的細(xì)胞群中，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強度呈對遞減。MTT檢測法：線粒體內(nèi)的脫氫酶可將黃色的MTT分解成紫色的水不溶性的甲瓚，并聚積在細(xì)胞中，死細(xì)胞無此功能，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力呈正比CCK8：優(yōu)點：a使用方便，省去了沖洗細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機溶劑b迅速檢測c矯捷度很高

6、d重復(fù)性優(yōu)于MTT法e細(xì)胞毒性小f檢測試劑無需預(yù)制，即開即用。弊端：a價格比較貴bCCK8試劑為淡紅色，與含酚紅的培育基顏色周邊，簡單漏加或多加Ki67（增殖細(xì)胞核抗原）：核增殖標(biāo)志物，無組織特異性，可靠、迅速反響增殖率細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)：形態(tài)學(xué)檢測：吉姆薩染色、瑞氏染色、Hoechst33342、Hoechst33258、DAPIAnnexinV：凋亡細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻到細(xì)胞膜外，AnnexinV是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白PI（碘化丙啶）染色：溴化乙錠的近似物，嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，常用于細(xì)胞凋亡檢測，能穿過破壞的細(xì)胞膜而對核染色。DNAFragmen

7、tation：凋亡細(xì)胞DNA在核小體間發(fā)生有規(guī)律的斷裂，出現(xiàn)180200bp的DNA片段，壞死細(xì)胞DNA斷裂為無特點的DNA片段，進行瓊脂糖電泳可區(qū)分凋亡和壞死。TUNEL（脫氧核糖核酸酶介導(dǎo)的缺口尾端標(biāo)志法）：細(xì)胞凋亡染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂產(chǎn)生大批的粘性3OH尾端，可在脫氧核糖核苷酸尾端轉(zhuǎn)移酶的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)志到DNA的3尾端，從而進行凋亡細(xì)胞的檢測。線粒體膜電位：親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強和減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高和降低（熒光顯微鏡檢測、FACS檢測）細(xì)胞色素C釋放：凋亡細(xì)胞中細(xì)胞色素C從線

8、粒體向胞質(zhì)釋放（分別抽提線粒體組分和細(xì)胞質(zhì)組分，用抗細(xì)胞色素C的抗體進行western-blot解析，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C由線粒體向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位）Caspase活性：Caspase3正常以酶原形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，可經(jīng)western-blot解析組織工程：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，將人體某部分的組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物質(zhì)料的支架進步行人工培育生殖、擴增，爾后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而達到器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù)。26組織工程3個支柱：種子細(xì)胞、生長因子、生長支架。27組織成立主要有3種方式：體內(nèi)成立：種子細(xì)胞與生物質(zhì)料復(fù)合后，組織還沒有完好形成時即植入體內(nèi)，組

9、織形成與生物質(zhì)料降解在體內(nèi)完成。體外成立：在體外模擬體內(nèi)環(huán)境，應(yīng)用生物反響器形成組織和器官。原位組織成立：單純植入生物質(zhì)料支架于體內(nèi)組織缺損部位，依賴周圍組織細(xì)胞遷移并粘附于生物質(zhì)料支架，形成并再生組織，這種方式其實不是經(jīng)典的組織工程看法。干細(xì)胞的主要特點：圓形或橢圓形、較高的端粒酶活性、增殖緩慢（機體需要時進入分化）、牢固增殖（保持自己數(shù)量）干細(xì)胞保持自穩(wěn)性的體系：不對稱分裂胚胎干細(xì)胞：從胚胎著床前胚胎的內(nèi)細(xì)胞團經(jīng)體外分化控制培育分其他一種全能性細(xì)胞，能夠分化成任何一種組織種類的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的分別方法：免疫法、組織培育法、顯微分別法iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞的異同：同樣：表達同樣的多能性mar

10、ker、全基因組比對幾乎同樣、都能夠培育出小鼠個體不同樣：定向分化能力有強弱33iPS細(xì)胞的優(yōu)勢：不用破壞胚胎，無倫理爭議、不需卵細(xì)胞，本源廣泛、無免疫排斥、可作為研究疾病的模型。34轉(zhuǎn)染：將外源分子（DNA、RNA）導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。35轉(zhuǎn)染的方法：磷酸鈣共積淀法、DEAE葡聚糖法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、納米顆粒作為載體的轉(zhuǎn)染、電穿孔法、顯微注射法、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法優(yōu)弊端比較：電穿孔法：優(yōu)點：轉(zhuǎn)染效率較高。弊端：需要昂貴的儀器，對細(xì)胞的傷害較大（需要更多的細(xì)胞和DNA）顯微注射法：優(yōu)點：轉(zhuǎn)外源基因沒有長度上的限制，目前已證明數(shù)百kbDNA片段均能成功。弊端：設(shè)備昂貴、操作技術(shù)需要長時間練習(xí)

11、、每次只能注射有限的細(xì)胞、不適合大批轉(zhuǎn)染細(xì)胞的需要。磷酸鈣共積淀法：優(yōu)點：低價、對某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高。弊端：細(xì)胞有限制性、重復(fù)性不好、渺小pH改變會以致轉(zhuǎn)染的失敗DEAE葡聚糖法：優(yōu)點：簡單、重復(fù)性比磷酸鈣共積淀法好、可轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。弊端：濃度高時有必然細(xì)胞毒性、不適用于牢固轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染時要除掉血清。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：優(yōu)點：適用于把DNA轉(zhuǎn)入懸浮和貼壁培育細(xì)胞，可用于瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)入效率高，比磷酸鈣法高5100倍、能夠轉(zhuǎn)染DNA和RNA、轉(zhuǎn)染的牢固性好，可重復(fù)性高。弊端：價格較貴，不適合大批量轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)體對細(xì)胞毒性較高，可能攪亂細(xì)胞代謝。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染：腺病毒載體：優(yōu)點：插入DNA片

12、段較長、宿主范圍廣，可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞、對人致病性低、不整合到染色體上，無插入致突變性、能同時表達多個基因、與人類基因同源，蛋白產(chǎn)物能有效折疊和修飾、能有效進行增殖，滴度高，外源基因表達效率高、病毒顆粒牢固，易于濃縮和純化。弊端：表達時間短，需屢次刺激、具有免疫原性，可能刺激宿主。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：優(yōu)點：能夠整合到宿主細(xì)胞、產(chǎn)生假病毒。弊端：只能感染能夠分裂的細(xì)胞、整合的時候會以致宿主基因組突變、有潛藏致瘤性。慢病毒載體：優(yōu)點：分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均能感染、能夠整合到基因組、免疫原性弱弊端：整合時同樣有可能以致宿主基因組突變。37轉(zhuǎn)染效率檢測方法：免疫熒光、流式、western、PCR瞬

13、時轉(zhuǎn)染：外源基因進入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體上，不整合到細(xì)胞的染色體上。外源基因?qū)爰?xì)胞1-2天后收獲細(xì)胞進行檢測和解析，一個宿主細(xì)胞可同時存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達。39牢固轉(zhuǎn)染：DNA整合到宿主細(xì)胞的染色體，外源DNA整合到染色體上的概率很小，大體1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合。平時需要一些選擇性標(biāo)志屢次精選，獲得牢固轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。40牢固轉(zhuǎn)染常用的精選藥物：G418、zeocin、Puromycin41影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染的主要因素：細(xì)胞狀態(tài)、血清、DNA質(zhì)量、轉(zhuǎn)染技術(shù)同源重組：將外源基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞染色體上的方法，因為在該座位有與導(dǎo)入基因同源的序列，經(jīng)過單一或雙交換，新基因片段可代替出

14、弊端的基因片段，達到修正弊端基因的目的。位點特異性重組：發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點上的重組，重組的發(fā)生需要一段同源序列即特異性位點（又稱附著點att）和位點特異性的蛋白因子即重組酶參加催化?；虼虬屑夹g(shù)：利用DNA同源重組的原理，在基因組中某一特定部位進行定點的基因重組，是研究基因功能的有效手段。包括基因敲除和基因敲入。反義核苷酸技術(shù)：經(jīng)人工合成和成立的反義表達載體表達的寡核苷酸片段，長度多為15-30個核苷酸，經(jīng)過堿基互補配對原理，與目的基因DNA或mRNA結(jié)合。46鋅指核酸酶技術(shù)：鑒別并結(jié)合指定的位點，高效且精確地切斷靶DNA。隨后細(xì)胞利用天然的DNA修復(fù)過程同源定向修復(fù)或非同源尾端連接來

15、治愈靶DNA的斷裂，就能夠進行基因組編寫，包括基因修復(fù)、基因刪除和定向的基因增加。（效率高、可成立knockout細(xì)胞、周期短、價格上沒有優(yōu)勢）TALEN（轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶）：一種人工核酸酶，是用于定向基因打靶的一種新技術(shù)，由轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子和核酸酶構(gòu)成。48TALEN基因敲除基本流程：a確定靶點bTAL靶點鑒別域的克隆成立c將TAL靶點鑒別域克隆入特定的真核表達載體以表達重組核酸酶d將重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞e精選突變體。49RNA攪亂技術(shù)：細(xì)胞利用外源或內(nèi)源小攪亂RNA激發(fā)相關(guān)的酶復(fù)合物，對同源性mRNA進行切割、降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達。50RNA攪亂現(xiàn)象的幾個

16、重要特點：轉(zhuǎn)錄后水平基因默然體系、很高的特異性、只有dsRNA才能引誘產(chǎn)生、只有針對編碼區(qū)的dsRNA才能產(chǎn)生有效和特異性的干擾、作用迅速、連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能有長遠(yuǎn)效應(yīng)。51siRNA制備的方法：化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、長片段dsRNAs經(jīng)RNase降解、siRNA表達載體在細(xì)胞中表達形成shRNAs、siRNA表達框架52siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法：磷酸鈣共積淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、DNA載體轉(zhuǎn)染、電穿孔法、顯微注射法、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染53siRNA收效檢測：從mRNA和蛋白質(zhì)兩方面進行：mRNA：RTPCR、實時定量PCR、Northern雜交蛋白質(zhì)：Western雜交、ELISA、免疫熒光54s

17、iRNA應(yīng)用：研究基因功能、基因治療領(lǐng)域、整形外科領(lǐng)域、藥物精選RNA攪亂存在的問題：AsiRNA導(dǎo)入體內(nèi)的效率低下，如何有效地將siRNA轉(zhuǎn)入體內(nèi)成為RNAi應(yīng)用的最大阻擋B體內(nèi)RNA遞送的靶向性C如何在目的基因的序列上選擇21-23nt左右的序列作為siRNA的模板，從目前的研究來看，序列的選擇原則尚不清楚siRNA的牢固性脫靶效應(yīng)，特別在多基因家族中的非特異性問題。56熒光漂白恢復(fù)（FRAP）：用來測定活細(xì)胞的動力學(xué)參數(shù)，借助于高強度脈沖激光來照射細(xì)胞某一地域，造成該地域熒光分子的光淬滅，該地域周圍的非淬滅熒光分子會以必然的速率向受照射地域擴散，這個擴散速率可經(jīng)過低強度激光掃描探測，所以

18、可獲得活細(xì)胞的動力學(xué)參數(shù)。57熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：分子能夠看作一個正負(fù)電荷分其他偶極子，受激發(fā)以必然的頻率振動，若是其周邊有一個振動頻率同樣的另一個分子存在，則經(jīng)過這兩個分子的偶極偶極相互作用，能量能夠非輻射方式從前者轉(zhuǎn)移到后者。58共聚焦顯微鏡（LSCM）應(yīng)用實例：組織光學(xué)切片、三維圖像重建、細(xì)胞物理與生物化學(xué)測定、熒光的定性定量解析、細(xì)胞內(nèi)離子的動向測量共聚焦顯微鏡的限制：標(biāo)志染料的光漂白：為了獲得足夠的信噪比，必定提高激光的強度，高強度的激光會使染料在連續(xù)掃描過程中迅速褪色。光毒作用：在激光照射下，好多熒光染料分子會產(chǎn)生單態(tài)氧和自由基等細(xì)胞毒素。活細(xì)胞成像技術(shù)的優(yōu)點：實時觀察、自動聚焦、單細(xì)胞追蹤、多位點成像、成像速度快、圖像清楚度高。61發(fā)光強度與熒光素的濃度、ATP濃度、和熒光素酶的濃度呈正相關(guān)（檢測熒光素酶、檢測ATP、檢測以熒光素）理想報告基因特點：沒有內(nèi)源性表達、易于定量、高矯捷度、線性范圍寬、反響迅速表面等離子共振技術(shù)（SPR）與等溫滴定微量熱技術(shù)（ITC）的同樣點：無需標(biāo)志、實時監(jiān)測、都適用于污濁、不透明或有色液體的檢測。胚胎工程內(nèi)容：胚胎切割、胚胎嵌合、細(xì)胞核移植、基因?qū)?、胚胎干?xì)胞、體外受精與胚胎移植。胚胎工程目的：輔助生育、生育保險