In-Fusion

克隆技術(shù)介紹July20,寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限企業(yè)新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第1頁(yè)主要內(nèi)容7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹2

1In-Fusion?技術(shù)原理

3In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例

4In-Fusion?應(yīng)用文件

2In-Fusion?試驗(yàn)方法新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第2頁(yè)In-Fusion?技術(shù)原理示意圖7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹3

In-Fusion酶Clontech專利50℃，15min單管反應(yīng)新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第3頁(yè)In-Fusion?技術(shù)特點(diǎn)7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹4

開放性無(wú)縫克隆多片段克隆In-Fusion不受載體限制不受酶切位點(diǎn)限制不附加任何冗余序列一次反應(yīng)單管操作陽(yáng)性率高達(dá)80%新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第4頁(yè)主要內(nèi)容7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹5

1In-Fusion?技術(shù)原理

3In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例

4In-Fusion?應(yīng)用文件

2In-Fusion?試驗(yàn)方法新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第5頁(yè)試驗(yàn)方法7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹6

引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增片段和載體酶切處理連接體系建立引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增載體線性化連接體系建立傳統(tǒng)基因克隆操作流程In-Fusion基因克隆操作流程新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第6頁(yè)引物設(shè)計(jì)7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹7

普通PCR引物In-FusionPCR引物保護(hù)堿基序列完整酶切位點(diǎn)與目標(biāo)基因片段相同/相互補(bǔ)特異堿基序列15bp同源堿基序列補(bǔ)齊酶切位點(diǎn)缺失堿基與目標(biāo)基因片段相同/相互補(bǔ)特異堿基序列5′--3′-3′5′-新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第7頁(yè)In-Fusion?引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹8

平末端和黏性末端均可直接進(jìn)行in-fusion連接選擇與載體末端相同的15bp同源堿基序列補(bǔ)齊酶切位點(diǎn)缺失堿基同源序列部分是與線性化載體末端5’end前15bp相互補(bǔ)堿基序列無(wú)需進(jìn)行末端補(bǔ)平或者去磷酸化處理若保留酶切位點(diǎn)，需補(bǔ)齊酶切位點(diǎn)缺失堿基新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第8頁(yè)In-Fusion?引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹9

平末端和黏性末端均可直接進(jìn)行in-fusion連接無(wú)需進(jìn)行末端補(bǔ)平或者去磷酸化處理新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第9頁(yè)In-Fusion?引物設(shè)計(jì)---標(biāo)準(zhǔn)17/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹10

黏性末端（5’懸掛）黏性末端（3’懸掛）

平末端新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第10頁(yè)In-Fusion?引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹11

選擇與載體末端相同的15bp同源堿基序列同源序列部分是與線性化載體末端5’end前15bp相互補(bǔ)堿基序列新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第11頁(yè)In-Fusion?引物設(shè)計(jì)---標(biāo)準(zhǔn)27/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹12

黏性末端（5’懸掛）黏性末端（3’懸掛）

平末端新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第12頁(yè)In-Fusion?引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹13

補(bǔ)齊酶切位點(diǎn)缺失堿基若保留酶切位點(diǎn)，需補(bǔ)齊酶切位點(diǎn)缺失堿基新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第13頁(yè)In-Fusion?引物設(shè)計(jì)---標(biāo)準(zhǔn)37/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹14

補(bǔ)齊酶切位點(diǎn)部分缺失堿基新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第14頁(yè)In-Fusion?引物設(shè)計(jì)在線工具7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹15

在線工具網(wǎng)址/CN/Support/Online_Tools

片段與載體用量計(jì)算工具PCR引物轉(zhuǎn)換工具新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第15頁(yè)載體線性化7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹16

PCR擴(kuò)增酶切處理新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第16頁(yè)建立In-Fusion?連接體系7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹17

RxnComponentCloningRxn5XIn-FusionHDEnzymePremix2μlLinearizedVectorxμl*PurifiedPCRFragmentxμl**dH2OxμlTotalVolume10μlLinearizedvector:PurifiedPCRfragment(摩爾比)=1:2*<0.5kb:10-50ng,0.5to10kb:50-100ng,>10kb:50-200ng**<10kb:50-100ng,>10kb:50-200ng新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第17頁(yè)主要內(nèi)容7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹18

3In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例

1In-Fusion?技術(shù)原理

4In-Fusion?應(yīng)用文件

2In-Fusion?試驗(yàn)方法新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第18頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹19

應(yīng)用多片段克隆插入突變構(gòu)建載體模型高通量克隆新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第19頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹20

1多片段克隆實(shí)驗(yàn)2插入突變實(shí)驗(yàn)In-FusionTMassembly:seamlessengineeringofmultidomainfusionproteins,modularvectors,andmutations.

BaogongZhu,GuifangCai,etal.

BioTechniques,Sep;

43:354-359新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第20頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例---多片段克隆7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹21

多片段連接---構(gòu)建真正無(wú)縫融合蛋白

將白細(xì)胞介素2(IL-2)分泌信號(hào)序列與CD101胞外域序列（刪除內(nèi)源性信號(hào)序列）和鼠免疫球蛋白

G3(IgG3)可結(jié)晶片段進(jìn)行融合，構(gòu)建無(wú)縫融合蛋白IL-2signal-CD101-Fc，并將其轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞檢測(cè)表示情況。實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)引物；擴(kuò)增目片段及載體線性化；建立In-Fusion連接反應(yīng)體系。新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第21頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例---多片段克隆7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹22

引物設(shè)計(jì)并擴(kuò)增目片段IL-2Signal,CD101和MurineIgG3IL-2SignalwithOverlapstoNcoI-DigestedVectorandCD101,88-bpPCRProductSense(NcoIunderlined)5′-TTCAAATCCACCATGGATAGAATGCAATTGTTG-3′Antisense5′-CTGTTACTTCTCTCTGAGAATTCGTAACCAAAGCCAAAGACAAAGCAATCA-3′CD101,2799-bpPCRProductSense5′-CAGAGAGAAGTAACAGTTCAGAAA-3′Antisense5′-GGCCGAGGAGCAGATCCTGGAA-3′MurineIgG3withOverlapstoCD101andSalI-DigestedVector,771-bpPCRProductSense5′-ATCTGCTCCTCGGCCCCTAGAATACCCAAGCCCAGTACC-3′Antisense(SalIunderlined)5′-AGTAACGTTAGTCGACTCAGTGTCTTGTAAGACCCGAGGA-3′新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第22頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例---多片段克隆7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹23

建立In-Fusion連接反應(yīng)體系（

10μl）IL-2SignalCD101DomainMurineIgG3FcTailVectorTotalTransformantsError-Free/Sequence(No.)88bp,1.6ng2799bp,49.3ng771bp,13.6ng11,365bp,100ng6901/2結(jié)論：克隆陽(yáng)性率為50%。轉(zhuǎn)染COS

細(xì)胞后，融合蛋白IL-2signal-CD101-Fc表示情況良好。新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第23頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹24

1多片段克隆實(shí)驗(yàn)2插入突變實(shí)驗(yàn)新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第24頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例---插入突變7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹25

插入突變---輕松實(shí)現(xiàn)插入突變實(shí)驗(yàn)流程確定突變位點(diǎn)；設(shè)計(jì)引物；擴(kuò)增目片段及載體線性化；建立In-Fusion連接反應(yīng)體系。新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第25頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例---插入突變7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹26

策略一5′SensePrimer(OverlapwithVectorUnderlined,SpeISiteBold) 5′-GCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTG-3′ AntisenseMutantPrimer(MutationUnderlined) 206-bpPCRProduct

5′-GAAGCGGATGAGTACAGACAGGGCAAAGTC-3′ SenseMutantPrimer(MutationUnderlined) 5′-TGTACTCATCCGCTTCTCACAACAGCAACAGC-3′ 3′AntisensePrimer(BspEISiteBold) 509-bpPCRproduct

5′-TGTGGCTTCCTCCGGAAGGGTGCTTGGGGTTA-3′ 引物設(shè)計(jì)并擴(kuò)增目片段206-bp和509-bp

將humanTIM-4(hTIM-4)第45位色氨酸（W或Trp）突變?yōu)楸彼幔ˋ或Ala），構(gòu)建hTIM-4W45A突變體。新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第26頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例---插入突變7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹27

建立In-Fusion連接反應(yīng)體系（

10μl）6375-bpfragmentcontainingthevectorand3′endofhTIM-4206-bpPCRProduct509-bpPCRproduct24ng1.6ng3.8ng結(jié)論：成功構(gòu)建了5個(gè)TIM-4突變體，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證，其克隆陽(yáng)性率

分別為3/3、3/3、2/3、2/3、1/8。新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第27頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例---插入突變7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹28

策略二4609-bpPCRProduct

SenseMutantPrimer(MutationUnderlined) 5′-AGTTGAGCCCAAATCTTCCGACAAAACTCACACA-3′AntisensePrimer 5′-GATTTGGGCTCAACTTTCTTGTCCACCTTGGTGT-3′

將人免疫球蛋白G1（IgG1）第103位半胱氨酸（C或Cys）突變?yōu)榻z氨酸（S或Ser），構(gòu)建IgG1C103S突變體。引物設(shè)計(jì)并擴(kuò)增目片段4609-bp結(jié)論：經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證，克隆陽(yáng)性率為33%。In-Fusion連接反應(yīng)體系（

10μl）4609-bpPCRProduct20ng新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第28頁(yè)主要內(nèi)容7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹29

4In-Fusion?應(yīng)用文件

3In-Fusion?應(yīng)用實(shí)例

1In-Fusion?技術(shù)原理

2In-Fusion?試驗(yàn)方法新克隆技術(shù)不用酶切位點(diǎn)直接克隆第29頁(yè)In-Fusion?應(yīng)用文件7/20/In-Fusion克隆技術(shù)介紹30

ComparativeEpigenomicAnalysisofMurineandHumanAdipogenesis

TarjeiS.Mikkelsen,ZhaoXu,etal.Cell,Oct;143:156–169In-FusionBioBrickassemblyandre-engineering

SeanC.Sleight,BryanA.Bartley,etal.NucleicAcidsRes.,May;38:2624-2636.LumenThiolOxidoreductase1,aDisulfideBond-FormingCatalyst,IsRequiredfortheAssemblyofPhotosystemIIinArabidopsis

MohamedKaramoko,SaraCline,KevinRedding,etal.PLANTCELL,Dec;23:4462-4475.EhrlichiachaffeensisTRP120InteractswithaDiverseArrayofEukaryoticProteinsInvolvedinTranscription,Signaling,andCytoskeletonOrganization

TianLuo,JeebaA.Kuriakose,BingZhu,etal.Infect.Immun.,Nov;79:4382-4391.GMechanismofauxiliaryβ-subunit-mediatedmembranetargetingofL-type(CaV1.2)channels

KunFangandHenryM.Colecraft.J.Physiol.,Sep;589:4437-4455.Crimean-C