兔腎原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)岳續(xù)朋2013-12-27如何獲得體外培養(yǎng)的細(xì)胞肺癌A549結(jié)腸癌colo320人腎上皮細(xì)胞293T肝癌HepG2原代培養(yǎng)是從供體取得細(xì)胞、組織或器官后在體外進(jìn)行首次培養(yǎng)直至成功地進(jìn)行首次傳代之前的培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞。

試劑75%乙醇PBS緩沖液（pH7.2）D-HanKs液（無鈣鎂離子）消化液（0.5%胰蛋白酶、0.02%EDTA1:1混合）0.4%臺酚藍(lán)RPMI-1640培養(yǎng)基(酚紅指示劑)原代培養(yǎng)方法流程圖組織塊培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法處死取材接種培養(yǎng)剪切清洗消化計數(shù)培養(yǎng)處死取材剪切清洗組織塊培養(yǎng)法動物處死取新生的家兔（出生2-3天）一只，用頸椎脫臼將其處死，浸入盛有75%乙醇的燒杯中5-10秒鐘，然后取出放在解剖平皿中送入超凈工作臺。取材用碘酒和75%的乙醇再次消毒一次，打開消毒器械包，用鑷子扯開腹部皮膚，用解剖剪剪開腹腔，暴露腹腔臟器，用另一個鑷子夾起腸管翻向一側(cè)，暴露出位于腹腔背側(cè)脊柱兩側(cè)的腎臟（左高右低），將其取下，放于消毒的培養(yǎng)皿中。組織塊培養(yǎng)法剪切剪開腎膜，剝向腎門，去除腎膜，用吸管吸取滅菌PBS（HnaKs液）將腎臟清洗3次，去除血污；將腎臟移入另一平皿中，將腎沿縱軸切開，減去腎盂，用眼科剪將腎組織反復(fù)剪切，直至0.5-1mm3組織塊。清洗剪切后的組織塊再用滅菌的PBS（HanKs液）沖洗數(shù)次，直到PBS澄清為止。消化培養(yǎng)法處死動物、取材、剪切以及組織塊的清洗都與組織塊培養(yǎng)法相同。將組織塊移入無菌的離心管中，靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉降到管底，棄上清。消化及分散組織塊向盛有組織塊的離心管中加入含EDTA的0.25%的胰蛋白酶，體積約為組織塊體積的5-8倍，與組織塊混勻后，置于37℃的水浴槽中消化10-20分鐘，其間每隔5分鐘搖動一次。當(dāng)組織塊變得疏松、顏色發(fā)白時，從水浴槽中取出離心管，加入2-3ml培養(yǎng)基，終止消化，用吸管反復(fù)吹打，直到大部分組織塊分散成單細(xì)胞或細(xì)胞團狀態(tài)為止，1000rpm離心5分鐘，棄去上清，再加入新鮮的培養(yǎng)基。將此細(xì)胞懸液用100目、200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾至燒杯中。消化培養(yǎng)法觀察接種培養(yǎng)后要每天觀察培養(yǎng)基是否污染，染色變化以及細(xì)胞生長狀況。培養(yǎng)基呈