對(duì)家蠶（鱗翅目：蠶蛾科）的兩種毒性敏感測(cè)試方法的比較（中文翻譯）摘要：家蠶不但是一種在經(jīng)濟(jì)上十分重要的昆蟲(chóng)，而且是研究殺蟲(chóng)劑對(duì)周圍環(huán)境影響的理想非靶標(biāo)生物。，用兩種毒性敏感測(cè)試方法浸葉法和定量噴霧法對(duì)五種殺蟲(chóng)劑進(jìn)行測(cè)試，將它們的農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果進(jìn)行比較得出兩種方法的不同之處?；谟蒙鲜鰞煞N方法對(duì)五種殺蟲(chóng)劑測(cè)試得出的半數(shù)致死濃度，可以得出五種殺蟲(chóng)劑對(duì)家蠶的毒性水平的次序結(jié)果如下：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽>高效氯氟氰菊酯>吡蟲(chóng)啉>毒死蜱>樂(lè)果。用浸葉法和定量噴霧法測(cè)試的殺蟲(chóng)劑個(gè)體的平均相對(duì)置信區(qū)間值是分別是：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（22.55%和19.03%），高效氟氯氰菊酯（18.03%和17.71%），吡蟲(chóng)啉（19.21%和16.96%），毒死蜱（17.20%和15.97%）和樂(lè)果（17.78%和15.81%）。而它們的變異系數(shù)值分別是甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（17.74%和5.44%），高效氟氯氰菊酯（21.15%和5.16%），吡蟲(chóng)啉（13.01%和5.65%），毒死蜱（16.72%和4.85%）和樂(lè)果（28.36%和7.93%）。本次研究的結(jié)果表明定量噴霧法在精確性和再現(xiàn)性上比浸葉法更加好。這次研究的結(jié)果為人們?cè)谵r(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估上選擇一種更加科學(xué)和理性的方法提供了十分有用的參考。簡(jiǎn)介家蠶，屬于鱗翅目大蠶蛾科，是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的昆蟲(chóng)。作為絲綢的主要生產(chǎn)者，家蠶在蠶業(yè)中充當(dāng)著主要貢獻(xiàn)者的角色已經(jīng)有5700年的歷史了，并且絲綢產(chǎn)業(yè)是中國(guó)一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源。目前，中國(guó)不僅擁有著世界最大桑樹(shù)種植面積而且是世界上最大的絲綢生產(chǎn)國(guó)。據(jù)估計(jì)，在2013年中國(guó)生產(chǎn)了648300噸的蠶繭，總值大約40億美元。家蠶是一種對(duì)殺蟲(chóng)劑等對(duì)環(huán)境有害的東西非常敏感的生物，尤其是當(dāng)它們處在一個(gè)隔離的環(huán)境中很長(zhǎng)一段時(shí)間的時(shí)候。因此，家蠶是研究殺蟲(chóng)劑的環(huán)境評(píng)估的理想非靶標(biāo)生物。殺蟲(chóng)劑的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估對(duì)家蠶來(lái)說(shuō)是非常重要的，因?yàn)樯?shù)的葉子隨時(shí)隨地都有可能暴露在殺蟲(chóng)劑的污染中。如果家蠶的幼蟲(chóng)吃到了受殺蟲(chóng)劑污染的桑葉，那將會(huì)對(duì)家蠶種群的生存造成嚴(yán)重的影響，這會(huì)直接嚴(yán)重地影響到絲綢工業(yè)的產(chǎn)量。近幾年來(lái)，家蠶被毒死的現(xiàn)象頻繁地出現(xiàn)，這引發(fā)了人們對(duì)環(huán)境安全的不斷關(guān)注。也正因?yàn)槿绱?，越?lái)越多的研究集中在殺蟲(chóng)劑對(duì)家蠶的影響，而與此相關(guān)的測(cè)試方法也在不斷地改進(jìn)。很多測(cè)試方法在對(duì)殺蟲(chóng)劑影響家蠶的毒性大小的判定上做了改進(jìn)，如夾心葉法，殘膜法，浸葉法和熏蒸法等。其中，浸葉法是最經(jīng)典的一種而且是中國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局推薦的測(cè)試方法。另一方面，一種最近發(fā)展起來(lái)的新方法，定量噴霧法，仍然需要更深入的研究和擴(kuò)展?？偹苤?，目前還沒(méi)有人同時(shí)運(yùn)用浸葉法和定量噴霧法在農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估上對(duì)殺蟲(chóng)劑進(jìn)行影響家蠶的毒性判定。因此，這次研究是為了將兩種毒性敏感測(cè)試方法做一個(gè)比較，從而找出一種為殺蟲(chóng)劑風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估生成數(shù)據(jù)的更好的方法。材料和方法測(cè)試?yán)ハx(chóng)。春雷X珍珠，這兩種在中國(guó)用來(lái)大規(guī)模商業(yè)家蠶養(yǎng)殖的品種將會(huì)被用作試驗(yàn)。從山東省廣通蠶種集團(tuán)有限公司獲得的這兩種家蠶品種對(duì)大多數(shù)殺蟲(chóng)劑都很敏感這些家蠶品種在我們實(shí)驗(yàn)室中使用超過(guò)10年了，因此我們對(duì)它們的飼養(yǎng)管理和各種問(wèn)題的處理有著豐富的經(jīng)驗(yàn)。這些家蠶最初獲得時(shí)還是一個(gè)個(gè)的蠶卵并被貯藏在冰柜中，只有在使用時(shí)才會(huì)把蠶卵取出來(lái)。蠶卵在合適的條件下會(huì)孵化出家蠶幼蟲(chóng)來(lái)，家蠶幼蟲(chóng)在實(shí)驗(yàn)室控制的環(huán)境條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室控制的環(huán)境條件如下如下，溫度：25±2℃；相對(duì)濕度：70-80%；光照時(shí)間：16小時(shí)：8小時(shí)（光照：黑暗）。要注意確保每只家蠶幼蟲(chóng)同時(shí)蛻皮并且個(gè)體差異要盡可能小。家蠶幼蟲(chóng)每天要用從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)的桑園里采集的沒(méi)有被殺蟲(chóng)劑處理過(guò)的成熟的桑葉喂四次，收集具有相似大小和體重的新蛻皮的二齡幼蟲(chóng)用作試驗(yàn)?；瘜W(xué)品。被選擇用做測(cè)試的下列五種殺蟲(chóng)劑，分別屬于四種不同的殺蟲(chóng)劑類型。五種殺蟲(chóng)劑分別是：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（純度：95%），高效氟氯氰菊酯（純度：94.8%），吡蟲(chóng)啉（純度：95.4%），毒死蜱（純度：96%）和樂(lè)果（純度：98%）。所有殺蟲(chóng)劑都是由農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所提供。每種殺蟲(chóng)劑都準(zhǔn)備了一份新鮮的貯備溶液，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、高效氟氯氰菊酯、吡蟲(chóng)啉和毒死蜱的0.1%貯備溶液是用丙酮和吐溫80稀釋的，而樂(lè)果的1%貯備溶液則是用蒸餾水稀釋的。隨后溶液的稀釋都用蒸餾水來(lái)進(jìn)行。試驗(yàn)步驟。浸葉法的步驟如下：首先將從桑樹(shù)采摘下來(lái)的清潔健康的桑葉放在經(jīng)過(guò)處理的一定劑量的殺蟲(chóng)劑沉浸10秒鐘。然后，將經(jīng)過(guò)風(fēng)干處理的桑葉平放在溫室培養(yǎng)皿上。將家蠶幼蟲(chóng)小心地放置在被處理過(guò)的桑葉頂部，并且在允許它們?cè)?6小時(shí)內(nèi)吃這些被殺蟲(chóng)劑處理過(guò)的桑葉。定量噴霧法的步驟如下：將重2-3g的新鮮有光澤的桑葉用殺蟲(chóng)劑噴霧處理。殺蟲(chóng)劑被均勻地噴在桑葉的背面，初始噴霧量為2ml，實(shí)驗(yàn)室噴霧塔的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)設(shè)為7個(gè)噴霧壓力和20s的液滴沉積時(shí)間。每片桑葉都要單獨(dú)稱重，在噴藥前和噴藥后立即用精確的秤來(lái)確定重量，使在每片桑葉上殺蟲(chóng)劑應(yīng)用的劑量被精確確定，為了降低桑葉的干燥速度，每個(gè)經(jīng)過(guò)風(fēng)干處理的桑葉的葉脈都插入了一個(gè)1.5ml的填充著1%瓊脂的離心管。將被處理過(guò)的桑葉平放在每個(gè)培養(yǎng)皿中，用殺蟲(chóng)劑處理過(guò)的葉面朝上。用軟刷將二十只家蠶幼蟲(chóng)小心地放在每一片桑葉的頂部。劑量的管理?？偟膩?lái)說(shuō)，每種殺蟲(chóng)劑在試驗(yàn)中都有五種濃度，在表一中已經(jīng)詳細(xì)列出來(lái)了，每種濃度之間相差的幾何級(jí)數(shù)為2，每種濃度都要用20只家蠶幼蟲(chóng)進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)。另外，水對(duì)照組還有甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、高效氟氯氰菊酯、吡蟲(chóng)啉、毒死蜱和樂(lè)果的溶劑對(duì)照組都在需要的實(shí)驗(yàn)組中設(shè)置了。曝光條件。在實(shí)驗(yàn)里，曝光籠子是一個(gè)直徑15厘米、高3厘米的溫室培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿在使用前要徹底清洗干凈，確保沒(méi)有任何殺蟲(chóng)劑殘留的痕跡。用于定量噴霧法實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)皿在試驗(yàn)中要一直處在打開(kāi)的狀態(tài)，以避免殺蟲(chóng)劑蒸汽在里面蓄積的可能情況。培養(yǎng)皿放置在與飼養(yǎng)條件一樣的氣候控制箱內(nèi)。觀察。在24小時(shí)、48小時(shí)和96小時(shí)的曝光中紀(jì)錄中毒和死亡的癥狀。這次實(shí)驗(yàn)是用96小時(shí)的半數(shù)致死濃度作為結(jié)果的，因?yàn)樵诒敬螌?shí)驗(yàn)條件下，這個(gè)時(shí)間段包含了絕大多數(shù)二齡幼蟲(chóng)所持續(xù)的時(shí)間，但這個(gè)時(shí)間一般還沒(méi)到達(dá)三齡幼蟲(chóng)開(kāi)始蛻皮的時(shí)候。數(shù)據(jù)分析。將從實(shí)驗(yàn)室獲得的測(cè)試數(shù)據(jù)通過(guò)對(duì)數(shù)或概率分析劑量反應(yīng)曲線或使用SPSS概率程序計(jì)算死亡率回歸方程。應(yīng)用Abbott方程式計(jì)算調(diào)整后的死亡率，其中死亡率是用百分比表示的。用以下方程調(diào)整只有溶劑的對(duì)照組的死亡率：調(diào)整后的死亡率=100X[實(shí)驗(yàn)組死亡率—對(duì)照組死亡率]/（100—對(duì)照組死亡率）。調(diào)整后的死亡率是用來(lái)計(jì)算家蠶的半數(shù)致死濃度的。同一種殺蟲(chóng)劑的毒性測(cè)試之間的差異是通過(guò)計(jì)算變異系數(shù)評(píng)估的。這是一個(gè)殺蟲(chóng)劑的半數(shù)致死濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差和該殺蟲(chóng)劑的平均半數(shù)致死濃度的比值。為了評(píng)估半數(shù)致死濃度的精確度，要算出死亡率的相對(duì)置信區(qū)間。相對(duì)置信區(qū)間是半數(shù)致死濃度值置信區(qū)間的寬度，可以使得半數(shù)致死濃度值的分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)化。它還是每個(gè)毒性測(cè)試所要計(jì)算的一半的總95%置信區(qū)間值和半數(shù)致死濃度的比值。結(jié)果殺蟲(chóng)劑毒性的比較。五種殺蟲(chóng)劑在毒性大小方面存在著明顯差異。它們的平均半數(shù)致死濃度值范圍在三個(gè)數(shù)量級(jí)之間。甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和高效氟氯氰菊酯屬于第一級(jí)。甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的毒性始終是最大的，其中通過(guò)浸葉法測(cè)出的平均半數(shù)致死濃度值是0.00058mg/l，而通過(guò)定量噴霧法測(cè)出的平均半數(shù)致死濃度值是0.0020mg/kg。而樂(lè)果的毒性始終是最小的，通過(guò)浸葉法測(cè)出的平均半數(shù)致死濃度值是815.08mg/l，而通過(guò)定量噴霧法測(cè)出的平均半數(shù)致死濃度是1320.62mg/kg。吡蟲(chóng)啉和毒死蜱的毒性大小為同一級(jí)別，都是中等毒性。用家蠶對(duì)五種殺蟲(chóng)劑進(jìn)行相對(duì)毒性測(cè)試，不論用哪一種方法，得出的結(jié)果都是一樣的，說(shuō)明這兩種方法都可以正確地測(cè)試出這些殺蟲(chóng)劑的相對(duì)毒性。測(cè)試系統(tǒng)的精度。在未經(jīng)處理的對(duì)照籠里家蠶幼蟲(chóng)的死亡率最高為5%（水對(duì)照組和溶劑對(duì)照組都是），這在設(shè)定的可接受上限10%之內(nèi)。表2給出了所有測(cè)試的相對(duì)置信區(qū)間值，這是為了計(jì)算半數(shù)致死濃度估計(jì)的精度。從計(jì)算出的每種殺蟲(chóng)劑通過(guò)浸葉法和定量噴霧法測(cè)出的平均相對(duì)置信區(qū)間值可以看出，每種殺蟲(chóng)劑可獲得的置信區(qū)間差異比較小。例如：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（22.55%和19.03%）、高效氟氯氰菊酯（18.03%和17.71%）、吡蟲(chóng)啉（19.21%和16.96%）、毒死蜱（17.20%和15.97%）和樂(lè)果（17.78%和15.81%）。這表明這些殺蟲(chóng)劑的半數(shù)致死濃度值的估計(jì)可以認(rèn)為是精確的。此外，對(duì)于每一種殺蟲(chóng)劑，通過(guò)定量噴霧法所獲得的平均相對(duì)置信區(qū)間值都要優(yōu)于通過(guò)浸葉法所獲得的值，這表明前者是更有效的方法。測(cè)試系統(tǒng)的變異性。同一種殺蟲(chóng)劑的毒性測(cè)試之間的變異系數(shù)值是為了衡量實(shí)驗(yàn)的變異性而計(jì)算的。這兩種方法的變異系數(shù)值如下：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（17.74%和5.44%）、高效氟氯氰菊酯（21.15%和5.16%）、吡蟲(chóng)啉（13.01%和5.65%）、毒死蜱（16.72%和4.85%）和樂(lè)果（28.36%和7.93%）。顯然，對(duì)于每一種殺蟲(chóng)劑個(gè)體來(lái)說(shuō)，從定量噴霧法所獲得的數(shù)據(jù)的變異系數(shù)值要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于從浸葉法所獲得的。在、通過(guò)這一點(diǎn)可以看出，定量噴霧法比浸葉法更有優(yōu)勢(shì)。模型擬合。在所有毒性測(cè)試中，通過(guò)對(duì)數(shù)或概率回歸模型可以獲得一個(gè)很適合的劑量響應(yīng)曲線（Pmin>0.876,表2）。因此，這些半數(shù)致死濃度的估計(jì)包括整體的分析都是有效的。討論用于監(jiān)管農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的毒性試驗(yàn)應(yīng)該是可重復(fù)的。在今次研究中，我們通過(guò)這兩種毒性敏感試驗(yàn)方法的比較來(lái)評(píng)估這兩種方法的優(yōu)劣。就像世間萬(wàn)物一樣，兩種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和不足。由于浸葉法的簡(jiǎn)單性，它被經(jīng)常地用在昆蟲(chóng)毒性的確定上。然而相對(duì)于其他殺蟲(chóng)劑風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法，這種方法有許多局限性。首先，浸葉法的結(jié)果只能用農(nóng)藥單位有效成分的量來(lái)表達(dá)，而不是用桑葉的每單位重量來(lái)表達(dá)，然而家蠶幼蟲(chóng)是與有殺蟲(chóng)劑的桑葉接觸而不是直接與殺蟲(chóng)劑噴霧接觸的。其次，很難甚至可以說(shuō)是不可能對(duì)桑葉上殺蟲(chóng)劑的含量進(jìn)行量化，這將會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)中同樣的處理是一個(gè)不確定的重復(fù)。最后，在桑葉風(fēng)干過(guò)程中會(huì)有大量的殺蟲(chóng)劑飛濺到測(cè)試環(huán)境中，造成環(huán)境的的污染。浸葉法的不足恰恰是定量噴霧法的優(yōu)點(diǎn)。定量噴霧法可以通過(guò)噴霧塔和測(cè)試前后的稱重將殺蟲(chóng)劑的使用進(jìn)行量化。這種方法還可以保證測(cè)試結(jié)果的精度和避免殺蟲(chóng)劑的浪費(fèi)。此外，定量噴霧法是用桑葉的每單位重量而不是用殺蟲(chóng)劑的劑量來(lái)作為表達(dá)結(jié)果的。然而，定量噴霧法的缺點(diǎn)在于操作過(guò)于麻煩和費(fèi)時(shí)。這次研究是第一次將浸葉法和定量噴霧法兩者進(jìn)行比較，但是對(duì)于定量噴霧法還需要更多更深入的細(xì)節(jié)研究。今次毒性試驗(yàn)，兩種方法都可以在不受時(shí)間和地點(diǎn)限制的條件下獲得相似的結(jié)果，證明這兩種方法都是很實(shí)用的。基于通過(guò)這兩種方法所獲得的這些殺蟲(chóng)劑的半數(shù)致死濃度值，可以得出這五種殺蟲(chóng)劑對(duì)家蠶的毒性水平如下：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽>高效氟氯氰菊酯>吡蟲(chóng)啉>毒死蜱>樂(lè)果。即便如此，這兩種方法的重現(xiàn)性、評(píng)估精度和半數(shù)致死濃度估計(jì)的變異程度還是很不一樣的。值得注意的是，本次研究的毒性結(jié)果與其他研究不同。其中一個(gè)很大的不同是本次研究利用劑量—響應(yīng)曲線的差異來(lái)計(jì)算半數(shù)致死濃度并將其作為可能結(jié)果的解釋。這兩種方法得到的結(jié)果的精度可以量化為半數(shù)致死濃度估計(jì)的相對(duì)置信區(qū)間值。眾所周知，相對(duì)置信區(qū)間越狹窄，半數(shù)致死濃度的估計(jì)可以認(rèn)為是越精確。就如上述定義所說(shuō)的，半數(shù)致死濃度的精度受不同的測(cè)試方法所影響，而浸葉法的相對(duì)置信區(qū)間比定量噴霧法要大。另一方面，殺蟲(chóng)劑的種類也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的精度。這在甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和高效氟氯氰菊酯的試驗(yàn)中尤其明顯。第三，通過(guò)選擇不同的劑量—響應(yīng)曲線可以提高實(shí)驗(yàn)的精度。在另一項(xiàng)研究中，用對(duì)數(shù)邏輯斯蒂回歸分析來(lái)計(jì)算半數(shù)致死濃度可以得到不同的結(jié)果。一些研究使用在95%上下的置信區(qū)間值作為殺蟲(chóng)劑對(duì)某些非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物的半數(shù)致死量估計(jì)的精度標(biāo)準(zhǔn)，并且認(rèn)為比值小于等于5是可以接受的。如表2所示，今次實(shí)驗(yàn)的置信區(qū)間比值在1.29到1.89的范圍內(nèi)，因此可以認(rèn)為本次實(shí)驗(yàn)的半數(shù)致死濃度的估計(jì)是非常精確的。每次試驗(yàn)之間的半數(shù)致死濃度值的變異性可以通過(guò)計(jì)算每種殺蟲(chóng)劑的半數(shù)致死濃度值的變異系數(shù)值來(lái)評(píng)估。在定量噴霧法中，所有殺蟲(chóng)劑的變異系數(shù)從不超過(guò)7.93%；而在浸葉法中，所有殺蟲(chóng)劑的變異系數(shù)從不超過(guò)28.36%。此外，與浸葉法相比，定量噴霧法在某些方面表現(xiàn)得更為優(yōu)秀。基于這項(xiàng)研究的結(jié)果，我們認(rèn)為這兩種用于殺蟲(chóng)劑風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的家蠶毒性敏感試驗(yàn)方法是應(yīng)該要具備可重復(fù)性。為了進(jìn)一步評(píng)估定量噴霧法的可重復(fù)性，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室環(huán)比測(cè)試。通過(guò)對(duì)比這兩種毒性敏感試驗(yàn)方法，我們可以看到