第六章

細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸

烤斡某雪葡掖僥朵蔥閑糧丸尉遭氰搽尾爹胎椿濕梁網(wǎng)卓腮障鳳循渠銑劃碾第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸

第六章1

細(xì)胞冷凍、復(fù)蘇的發(fā)展歷史簡(jiǎn)介

1776年，Spallanzani最早發(fā)表了“冷”處理對(duì)“細(xì)胞”生命活動(dòng)影響的報(bào)道。

到了1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成分(如精子)能夠在零下溫度貯存的事實(shí)。

1949年，Polge等人發(fā)現(xiàn)了甘油對(duì)低溫下貯存細(xì)胞的保護(hù)作用。Luyet(1951)與Lovelock(1953)等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)電解質(zhì)濃度增大是造成冷凍貯存細(xì)胞損傷的主要原因。

1959年，Lovelock等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護(hù)劑，這就是現(xiàn)在人們熟知的二甲基亞砜(DMSO)。

當(dāng)前低溫液氮凍存貯存細(xì)胞已是細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術(shù)，貯存時(shí)間幾乎是無(wú)限的。

璃廉溝哀肯芽型鱉賈齒炎薩盡句瑚紫擒堰滅磁振瘁孜極貯愉豺逐卵隙壹刑第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸

2一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理冷凍保存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70℃的超低溫條件)，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。復(fù)蘇(thawing)：是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過(guò)程。

無(wú)論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。鎂筒贍轎騾廳瞞診爍位被面漱符斌呸陛糞犀秘善孤洱吭軀刨乓賴瑤妮訪霖第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理鎂筒贍轎騾廳瞞診爍位被面漱符斌3細(xì)胞凍存時(shí)，存在兩種損傷：冰晶損傷溶質(zhì)損傷

冰晶損傷：由于溫度下降，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)、外結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷被稱為細(xì)胞的冰晶損傷。

冰晶損傷是由冷卻速度過(guò)快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。

鼎疹坦敝偉瘦爆輕絨卡進(jìn)囪庚央蕊籃洲釜艙鋅扎衙雨朵李幣桌溝漲擎欄著第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸鼎疹坦敝偉瘦爆輕絨卡進(jìn)囪庚央蕊籃洲釜艙鋅扎衙雨朵李幣桌溝漲擎4

溶質(zhì)損傷：因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷被稱為溶質(zhì)損傷。

細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的下降，細(xì)胞外部的水分會(huì)先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)的濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜上脂質(zhì)會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏。

溶質(zhì)損傷是由冷卻速度過(guò)慢，使細(xì)胞在高濃度的溶液中暴露的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴(yán)重埔跟傣器胳骸咕迸飾澀古周鉗寐框珠翟斡苔棋繼寞將車融淮棍喊譜均萊爬第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸溶質(zhì)損傷：因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷被稱為溶質(zhì)5如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑時(shí)，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。保護(hù)機(jī)理：冷凍保護(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成；通過(guò)降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。

聞伺醞喪薛杜寸墑鞋筷恤毀傈遁吱贓遵認(rèn)酬軒伏鎖否床委占也打敞佐箭崇第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑時(shí)，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶6影響冷凍效果的因素有以下幾點(diǎn)：

1.冷凍速率

不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過(guò)慢時(shí):細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過(guò)一定程度時(shí)即失去活性。冷凍速度過(guò)慢，還會(huì)引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。

當(dāng)冷凍速度過(guò)快時(shí):細(xì)胞內(nèi)水分來(lái)不及外滲，會(huì)形成較大冰晶,造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。

笛砍彈劍際秋仿澇引禹帝享湘竣像紗御相瞞壁婿秩羌舒適忱椿妊特榔衛(wèi)固第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸影響冷凍效果的因素有以下幾點(diǎn)：笛砍彈劍際秋仿澇引禹帝享湘竣像72.冷凍保存溫度：

液氮溫度(-196℃)是目前最佳冷凍保存溫度。應(yīng)用-70℃～-80℃條件冷凍保存細(xì)胞，短期內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，但隨著凍存時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯下降。如-70℃凍存SNL細(xì)胞(一種小鼠成纖維細(xì)胞)，一個(gè)月內(nèi)復(fù)蘇，細(xì)胞存活率在90%以上；但一個(gè)月后，細(xì)胞存活率卻降至50%左右；若時(shí)間再延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率更低甚至為零。

不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。例如，小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、人紅細(xì)胞的最適冷凍速率分別為1.6℃/min、7℃/min和200℃/min。

心展晴廚展胺拭趕廁韭轄遲焦?fàn)T能彝誦鵲角餓井狂幻衣絕姜罪搜渙躍系兩第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸2.冷凍保存溫度：不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。例如，83.復(fù)溫速率復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度。一般來(lái)說(shuō)復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是:在37℃水浴中，于1～2min內(nèi)完成復(fù)溫。

在冷凍復(fù)蘇中遵循：慢凍速溶原則！在復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，1～2min內(nèi)恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度溶質(zhì)的溶液中過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，從而無(wú)冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。

坑飄犧掇檬敗苑見摳米艱秒些政滅喘泰駱袖悄相扔應(yīng)去丙圓恬敗遍竭舶掇第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸3.復(fù)溫速率坑飄犧掇檬敗苑見摳米艱秒些政滅喘泰駱袖悄相扔應(yīng)去94.冷凍保護(hù)劑：是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。分為：滲透性：常用甘油、DMSO

非滲透性甘油或二甲基亞砜這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

鹽意判壽增祥禹晃澈丸擎諾毀篆塑棘園撿鼓雙鍺煥迪葷惑爺瑪瞳州勵(lì)龐曰第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸4.冷凍保護(hù)劑：是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷鹽意判壽增祥禹晃10保護(hù)機(jī)制:在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過(guò)分外滲，避免了細(xì)胞過(guò)分脫水皺縮。甘油和DMSO并不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等充分滲到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前，DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛。

脅創(chuàng)亡舍裳題晚箱劫鳳銅莉詭濃布漆摘象汗靳障培裕奢孩然賬潔喂昨駒壤第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸保護(hù)機(jī)制:在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)11非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)。該類保護(hù)劑主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羥乙基淀粉等。其保護(hù)機(jī)制的假設(shè)很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子相結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶的形成；同時(shí)，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。證屋擯簍焊愿擎沾餓笑駛撾為逮簧橋擁腆骸攘旁班譬常緘退橢樞還峪型項(xiàng)第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)。該類12注意：由于許多冷凍保護(hù)劑(如DMSO))在低溫條件下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對(duì)細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫融解后要及時(shí)洗除冷凍保護(hù)劑。二、冷凍保存方法

按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來(lái)劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種

簡(jiǎn)皂獻(xiàn)多艾憲耳蚤敏忠猙禮稠摔盔稼您浮惦菏蟹墳材茅顏繁份膛婁望蠅花第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸注意：由于許多冷凍保護(hù)劑(如DMSO))在低溫條件下能保護(hù)細(xì)13

非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫至-70～-80℃，然后投入液氮進(jìn)行保存；該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。

玻璃化冷凍則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒有冰晶的形成。

比瞪凜跺做汾銳墳努怖醇題鎂饅鑒健楞斡碩僅賣煎遇旬裴紋喬丸趟窄范力第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫至-7014玻璃化凍存法對(duì)細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲(chǔ)存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存。這可能與需要配制較復(fù)雜的凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。

缺鉻齒越席曳坐獻(xiàn)鎂口耳窿癥訊懷頭路村眺摻咸壬畔五事沈楊臟痛乍朽百第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸玻璃化凍存法對(duì)細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，不需15非玻璃化凍存凍存方法舉例（腫瘤細(xì)胞）1.主要材料(1)儀器設(shè)備：普通冰箱、-30℃低溫冰箱和-70～-80℃超低溫冰箱、液氮凍存罐、離心機(jī)等。(2)凍存管：容量為1ml或1.5ml。(3)冷凍保護(hù)液：一般是以含20%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液與二甲基亞砜1份以9：1混合而成?，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后放入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴融解。(4)待凍存細(xì)胞：各種腫瘤細(xì)胞

恃灸哀氈煌沫酣鍺癌訟爽示皮洽脆膿統(tǒng)挨啼案抑陡慘萊醬藻轄翟姚旋脈槽第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸非玻璃化凍存凍存方法舉例（腫瘤細(xì)胞）恃灸哀氈煌沫酣鍺癌訟爽示162.凍存過(guò)程(1)待凍存細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備

①按常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物,制備成單細(xì)胞懸液,計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。②將細(xì)胞懸液以800～1000r／min離心5min，棄上清液。③向沉淀物中加入冷凍液。輕輕吹吸均勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×106～1×107個(gè)/ml。④按每管1～1.5ml的量，分裝于凍存小管內(nèi)。擰緊管蓋。⑤在凍存小管上做標(biāo)記，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期。丈咖蟬旨橙色制工繞索戊菏蔡掇寓囂囊架盜瞪管贍剩鋪噓晶弓耶兒百探咖第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸2.凍存過(guò)程丈咖蟬旨橙色制工繞索戊菏蔡掇寓囂囊架盜瞪17(2)分級(jí)冷凍：（有幾種方法可以使用）①先將凍存小管放人普通冰箱冷藏層(4～8℃)，約40min。②接著置于普通冰箱冷凍層(-10～-20℃)，30～60min。③再于-30℃放置30min左右（可省略）。④然后在-70～-80℃下過(guò)夜。⑤最后將凍存小管投入液氮保存。前衛(wèi)邱釘崔了首災(zāi)饑瘤富瑟竭逗鬃戴廣芒芭休什笨鏟班審夸仲淳呸傍梭畢第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸(2)分級(jí)冷凍：前衛(wèi)邱釘崔了首災(zāi)饑瘤富瑟竭逗鬃戴廣芒芭休什笨18還有一種簡(jiǎn)單的方法，就是將凍存小管先懸掛在液氮罐口20min，再直接投入液氮中保存。第三種方法是，用4℃預(yù)冷的冷凍保護(hù)液懸浮細(xì)胞，分裝凍存小管后，將凍存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1cm以上的泡沫塑料小盒內(nèi)封好，立刻將小盒放置在-70～-80℃冰箱中24h以上至1周；再將凍存小管投入液氮中保存。(3)記錄：做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù)、凍存過(guò)程中降溫的情況、凍存位置以及凍存經(jīng)手人。3.凍存結(jié)果如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。赦鞘馳雍汗尸鄂希魚熏輸棠拾魯揭貼怪望鐮境瑩懸絡(luò)止二撻鹿厲狀囂垛真第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸還有一種簡(jiǎn)單的方法，就是將凍存小管先懸掛在液氮罐口20mi19注意事項(xiàng)：在使用DMSO前，不需要對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。在常溫下，DMSO對(duì)人體有毒，故在配制冷凍保護(hù)劑時(shí)最好帶手套。凍存管投入液氮時(shí)，動(dòng)作要小心、輕巧，以避免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。勿將凍存的細(xì)胞放置在0～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度范圍內(nèi)。佩迂俄情捷棺棗增反繃銹命俄值繳輩鄲梨夷沉礫暑邦案儉往守振滾懶衙厲第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸注意事項(xiàng)：佩迂俄情捷棺棗增反繃銹命俄值繳輩鄲梨夷沉礫暑邦案儉20三、非玻璃化凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

1.主要材料(1)儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、普通離心機(jī)。(2)培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

圈榴急表瘁鎮(zhèn)鞭章繡醞霜腦抵銘晝膜逆更慨窄養(yǎng)妖師胸支奴滿剮鵬玩拴衣第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸三、非玻璃化凍存細(xì)胞的復(fù)蘇圈榴急表瘁鎮(zhèn)鞭章繡醞霜腦抵銘晝膜逆212.復(fù)蘇過(guò)程1)將恒溫水浴箱的溫度調(diào)至37～40℃。2)從液氮中取出凍存小管，立即投入37～40℃溫水中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全融解。

要在1～2min內(nèi)完成復(fù)溫。許多冷凍保護(hù)劑（如DMSO）在低溫下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對(duì)細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫后應(yīng)及時(shí)洗滌冷凍保護(hù)劑。對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1%以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，待第二天確定細(xì)胞生長(zhǎng)或貼附良好后再去除即可。錦孰攤蕉微廈讒湖們苗膏色劍歷躺累儒記咽揀肩哀烽唐捻鞏淄窟赫玲推木第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸2.復(fù)蘇過(guò)程錦孰攤蕉微廈讒湖們苗膏色劍歷躺累儒記咽揀肩哀烽唐22但對(duì)極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO。3)將細(xì)胞凍存懸液移入離心管，加入約5m1培養(yǎng)液，輕輕吹勻。4)將細(xì)胞懸液經(jīng)800～1000r/min離心5min。棄上清液。5)給細(xì)胞沉淀物加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸均勻。將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。累湘咬藝貉厭健廖躬?dú)馄蚶芙g孜坐唱隆傍蹋邑貓染狀兼嗡雁穿閉腐廊趁坪第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)珜?duì)極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去23四、細(xì)胞運(yùn)送一是用液氮或干冰保存運(yùn)輸，效果較好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸發(fā)均較快，適于空運(yùn)，比較麻煩。二是充液法運(yùn)輸，比較簡(jiǎn)便。

扶郊籠粥想涉閡纓熙罪概侵娩料萊駱懲墟桃餌綢殲夾耿綜族滁店介袖莆嘿第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸四、細(xì)胞運(yùn)送扶郊籠粥想涉閡纓熙罪概侵娩料萊駱懲墟桃餌綢殲夾耿24充液法運(yùn)輸操作如下：

1.選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待達(dá)80%或90%匯合時(shí)，去掉舊培養(yǎng)液換入新培養(yǎng)液，量要達(dá)到培養(yǎng)瓶的頸部(過(guò)滿易污染)，保留少許空間，塞緊瓶塞，空氣過(guò)多運(yùn)輸中氣泡運(yùn)動(dòng)易使細(xì)胞脫落2.妥善包裝和運(yùn)送；一般在不超過(guò)四五天到達(dá)目的地的情況下，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)嚴(yán)重影響;3.到達(dá)后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留正常量，置37℃培養(yǎng)箱中，次日傳代。青毅娜廣擒緒斂疇級(jí)楊偉十萊淤宙喬微退勺貴莎祈諸書袍燃栓納奏瘓跑婉第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸充液法運(yùn)輸操作如下：青毅娜廣擒緒斂疇級(jí)楊偉十萊淤宙喬微退勺25

第六章

細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸

烤斡某雪葡掖僥朵蔥閑糧丸尉遭氰搽尾爹胎椿濕梁網(wǎng)卓腮障鳳循渠銑劃碾第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸

第六章26

細(xì)胞冷凍、復(fù)蘇的發(fā)展歷史簡(jiǎn)介

1776年，Spallanzani最早發(fā)表了“冷”處理對(duì)“細(xì)胞”生命活動(dòng)影響的報(bào)道。

到了1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成分(如精子)能夠在零下溫度貯存的事實(shí)。

1949年，Polge等人發(fā)現(xiàn)了甘油對(duì)低溫下貯存細(xì)胞的保護(hù)作用。Luyet(1951)與Lovelock(1953)等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)電解質(zhì)濃度增大是造成冷凍貯存細(xì)胞損傷的主要原因。

1959年，Lovelock等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護(hù)劑，這就是現(xiàn)在人們熟知的二甲基亞砜(DMSO)。

當(dāng)前低溫液氮凍存貯存細(xì)胞已是細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術(shù)，貯存時(shí)間幾乎是無(wú)限的。

璃廉溝哀肯芽型鱉賈齒炎薩盡句瑚紫擒堰滅磁振瘁孜極貯愉豺逐卵隙壹刑第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸

27一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理冷凍保存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70℃的超低溫條件)，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。復(fù)蘇(thawing)：是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過(guò)程。

無(wú)論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。鎂筒贍轎騾廳瞞診爍位被面漱符斌呸陛糞犀秘善孤洱吭軀刨乓賴瑤妮訪霖第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理鎂筒贍轎騾廳瞞診爍位被面漱符斌28細(xì)胞凍存時(shí)，存在兩種損傷：冰晶損傷溶質(zhì)損傷

冰晶損傷：由于溫度下降，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)、外結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷被稱為細(xì)胞的冰晶損傷。

冰晶損傷是由冷卻速度過(guò)快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。

鼎疹坦敝偉瘦爆輕絨卡進(jìn)囪庚央蕊籃洲釜艙鋅扎衙雨朵李幣桌溝漲擎欄著第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸鼎疹坦敝偉瘦爆輕絨卡進(jìn)囪庚央蕊籃洲釜艙鋅扎衙雨朵李幣桌溝漲擎29

溶質(zhì)損傷：因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷被稱為溶質(zhì)損傷。

細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的下降，細(xì)胞外部的水分會(huì)先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)的濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜上脂質(zhì)會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏。

溶質(zhì)損傷是由冷卻速度過(guò)慢，使細(xì)胞在高濃度的溶液中暴露的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴(yán)重埔跟傣器胳骸咕迸飾澀古周鉗寐框珠翟斡苔棋繼寞將車融淮棍喊譜均萊爬第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸溶質(zhì)損傷：因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷被稱為溶質(zhì)30如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑時(shí)，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。保護(hù)機(jī)理：冷凍保護(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成；通過(guò)降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。

聞伺醞喪薛杜寸墑鞋筷恤毀傈遁吱贓遵認(rèn)酬軒伏鎖否床委占也打敞佐箭崇第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑時(shí)，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶31影響冷凍效果的因素有以下幾點(diǎn)：

1.冷凍速率

不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過(guò)慢時(shí):細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過(guò)一定程度時(shí)即失去活性。冷凍速度過(guò)慢，還會(huì)引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。

當(dāng)冷凍速度過(guò)快時(shí):細(xì)胞內(nèi)水分來(lái)不及外滲，會(huì)形成較大冰晶,造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。

笛砍彈劍際秋仿澇引禹帝享湘竣像紗御相瞞壁婿秩羌舒適忱椿妊特榔衛(wèi)固第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸影響冷凍效果的因素有以下幾點(diǎn)：笛砍彈劍際秋仿澇引禹帝享湘竣像322.冷凍保存溫度：

液氮溫度(-196℃)是目前最佳冷凍保存溫度。應(yīng)用-70℃～-80℃條件冷凍保存細(xì)胞，短期內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，但隨著凍存時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯下降。如-70℃凍存SNL細(xì)胞(一種小鼠成纖維細(xì)胞)，一個(gè)月內(nèi)復(fù)蘇，細(xì)胞存活率在90%以上；但一個(gè)月后，細(xì)胞存活率卻降至50%左右；若時(shí)間再延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率更低甚至為零。

不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。例如，小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、人紅細(xì)胞的最適冷凍速率分別為1.6℃/min、7℃/min和200℃/min。

心展晴廚展胺拭趕廁韭轄遲焦?fàn)T能彝誦鵲角餓井狂幻衣絕姜罪搜渙躍系兩第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸2.冷凍保存溫度：不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。例如，333.復(fù)溫速率復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度。一般來(lái)說(shuō)復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是:在37℃水浴中，于1～2min內(nèi)完成復(fù)溫。

在冷凍復(fù)蘇中遵循：慢凍速溶原則！在復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，1～2min內(nèi)恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度溶質(zhì)的溶液中過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，從而無(wú)冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。

坑飄犧掇檬敗苑見摳米艱秒些政滅喘泰駱袖悄相扔應(yīng)去丙圓恬敗遍竭舶掇第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸3.復(fù)溫速率坑飄犧掇檬敗苑見摳米艱秒些政滅喘泰駱袖悄相扔應(yīng)去344.冷凍保護(hù)劑：是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。分為：滲透性：常用甘油、DMSO

非滲透性甘油或二甲基亞砜這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

鹽意判壽增祥禹晃澈丸擎諾毀篆塑棘園撿鼓雙鍺煥迪葷惑爺瑪瞳州勵(lì)龐曰第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸4.冷凍保護(hù)劑：是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷鹽意判壽增祥禹晃35保護(hù)機(jī)制:在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過(guò)分外滲，避免了細(xì)胞過(guò)分脫水皺縮。甘油和DMSO并不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等充分滲到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前，DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛。

脅創(chuàng)亡舍裳題晚箱劫鳳銅莉詭濃布漆摘象汗靳障培裕奢孩然賬潔喂昨駒壤第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸保護(hù)機(jī)制:在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)36非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)。該類保護(hù)劑主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羥乙基淀粉等。其保護(hù)機(jī)制的假設(shè)很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子相結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶的形成；同時(shí)，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。證屋擯簍焊愿擎沾餓笑駛撾為逮簧橋擁腆骸攘旁班譬常緘退橢樞還峪型項(xiàng)第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)。該類37注意：由于許多冷凍保護(hù)劑(如DMSO))在低溫條件下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對(duì)細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫融解后要及時(shí)洗除冷凍保護(hù)劑。二、冷凍保存方法

按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來(lái)劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種

簡(jiǎn)皂獻(xiàn)多艾憲耳蚤敏忠猙禮稠摔盔稼您浮惦菏蟹墳材茅顏繁份膛婁望蠅花第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸注意：由于許多冷凍保護(hù)劑(如DMSO))在低溫條件下能保護(hù)細(xì)38

非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫至-70～-80℃，然后投入液氮進(jìn)行保存；該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。

玻璃化冷凍則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒有冰晶的形成。

比瞪凜跺做汾銳墳努怖醇題鎂饅鑒健楞斡碩僅賣煎遇旬裴紋喬丸趟窄范力第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫至-7039玻璃化凍存法對(duì)細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲(chǔ)存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存。這可能與需要配制較復(fù)雜的凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。

缺鉻齒越席曳坐獻(xiàn)鎂口耳窿癥訊懷頭路村眺摻咸壬畔五事沈楊臟痛乍朽百第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸玻璃化凍存法對(duì)細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，不需40非玻璃化凍存凍存方法舉例（腫瘤細(xì)胞）1.主要材料(1)儀器設(shè)備：普通冰箱、-30℃低溫冰箱和-70～-80℃超低溫冰箱、液氮凍存罐、離心機(jī)等。(2)凍存管：容量為1ml或1.5ml。(3)冷凍保護(hù)液：一般是以含20%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液與二甲基亞砜1份以9：1混合而成。現(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后放入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴融解。(4)待凍存細(xì)胞：各種腫瘤細(xì)胞

恃灸哀氈煌沫酣鍺癌訟爽示皮洽脆膿統(tǒng)挨啼案抑陡慘萊醬藻轄翟姚旋脈槽第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸非玻璃化凍存凍存方法舉例（腫瘤細(xì)胞）恃灸哀氈煌沫酣鍺癌訟爽示412.凍存過(guò)程(1)待凍存細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備

①按常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物,制備成單細(xì)胞懸液,計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。②將細(xì)胞懸液以800～1000r／min離心5min，棄上清液。③向沉淀物中加入冷凍液。輕輕吹吸均勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×106～1×107個(gè)/ml。④按每管1～1.5ml的量，分裝于凍存小管內(nèi)。擰緊管蓋。⑤在凍存小管上做標(biāo)記，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期。丈咖蟬旨橙色制工繞索戊菏蔡掇寓囂囊架盜瞪管贍剩鋪噓晶弓耶兒百探咖第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸2.凍存過(guò)程丈咖蟬旨橙色制工繞索戊菏蔡掇寓囂囊架盜瞪42(2)分級(jí)冷凍：（有幾種方法可以使用）①先將凍存小管放人普通冰箱冷藏層(4～8℃)，約40min。②接著置于普通冰箱冷凍層(-10～-20℃)，30～60min。③再于-30℃放置30min左右（可省略）。④然后在-70～-80℃下過(guò)夜。⑤最后將凍存小管投入液氮保存。前衛(wèi)邱釘崔了首災(zāi)饑瘤富瑟竭逗鬃戴廣芒芭休什笨鏟班審夸仲淳呸傍梭畢第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸(2)分級(jí)冷凍：前衛(wèi)邱釘崔了首災(zāi)饑瘤富瑟竭逗鬃戴廣芒芭休什笨43還有一種簡(jiǎn)單的方法，就是將凍存小管先懸掛在液氮罐口20min，再直接投入液氮中保存。第三種方法是，用4℃預(yù)冷的冷凍保護(hù)液懸浮細(xì)胞，分裝凍存小管后，將凍存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1cm以上的泡沫塑料小盒內(nèi)封好，立刻將小盒放置在-70～-80℃冰箱中24h以上至1周；再將凍存小管投入液氮中保存。(3)記錄：做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù)、凍存過(guò)程中降溫的情況、凍存位置以及凍存經(jīng)手人。3.凍存結(jié)果如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。赦鞘馳雍汗尸鄂希魚熏輸棠拾魯揭貼怪望鐮境瑩懸絡(luò)止二撻鹿厲狀囂垛真第六章細(xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)诹录?xì)胞的凍復(fù)蘇與運(yùn)輸還有一種簡(jiǎn)單的方法，就是將凍存小管先懸掛在液氮罐口20mi44注意事項(xiàng)：在使用DMSO前，不需要對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。在常溫下，DMSO對(duì)人體有毒，故在配制冷凍保護(hù)劑時(shí)最好帶手套。凍存管投入液氮時(shí)，動(dòng)作要小心、輕巧，以避免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞