iTRAQ定量蛋白質組學iTRAQ定量蛋白質組學主要內容iTRAQ技術簡介iTRAQ試劑標記原理iTRAQ技術優(yōu)勢iTRAQ實驗流程iTRAQ實驗結果示例iTRAQ實驗詳細步驟主要內容iTRAQ技術簡介iTRAQ技術簡介iTRAQ技術是由美國應用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystemsIncorporation，ABI)2004年開發(fā)的同重標簽標記的相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技術。iTRAQ試劑是可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側鏈氨基）連接的胺標記同重元素。在一級質譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記不同樣本中的同一蛋白質表現(xiàn)為相同的質荷比。在一級質譜中，不同來源的相同肽段表現(xiàn)為一個峰；在二級質譜中，iTRAQ試劑中的平衡基團發(fā)生中性丟失，信號離子表現(xiàn)為不同質荷比(114～121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達差異；同時，肽段的MS/MS結果結合數(shù)據(jù)庫檢索可以鑒定出相應的蛋白種類。iTRAQ技術簡介iTRAQ技4NCBI截止現(xiàn)在為1773篇4NCBI截止現(xiàn)在為1773篇5相關雜志對重復性要求5相關雜志對重復性要求※首選2-3次生物重復，最好3次或以上組內樣品個體差異大的材料需要更多的生物重復生物學重復樣品較多時，可以適當混合以減少樣品數(shù)目無任何重復，可以結合其他技術進行驗證6建議※首選2-3次生物重復，最好3次或以上6建議iTRAQ試劑標記原理報告部分共有8種：質量數(shù)分別為114~121Da，因此iTRAQ最多可同時標記8組樣品（客戶可按需選擇標記個數(shù)）。肽反應部分：能與肽鏈N端及賴氨酸側鏈發(fā)生共價連接，從而將報告部分和平衡部位標記到肽段上，幾乎可以標記所有蛋白質。平衡部分：質量數(shù)分別為31~24Da，與報告部分相互配合，保證iTRAQ試劑標記的不同樣本的同一肽段具有相同的質荷比。iTRAQ試劑標記原理報告部分共有8種：質量數(shù)分別為114圖1iTRAQ技術原理圖圖1iTRAQ技術原理圖iTRAQ技術優(yōu)勢靈敏度高：可檢測出低豐度蛋白；分離能力強:可分離出酸/堿性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等；適用范圍廣：可以對任何類型的蛋白質進行鑒定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：可同時對8個樣本進行分析，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析；結果可靠：定性與定量同步進行，同時給出每一個組分的相對表達水平、分子量和豐富的結構信息；自動化程度高：液質連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。iTRAQ技術優(yōu)勢靈敏度高：可檢測出低豐度蛋白；iTRAQ實驗流程iTRAQ實驗流程。

1：收集不同組別的樣本并分別提取蛋白質；

2：蛋白質經(jīng)過還原，封閉后用胰蛋白酶酶切；

3：各組樣本的肽段混合物分別用不同的iTRAQ試劑標記；

4：等量混合各樣本中的標記肽段；

5：MS/MS質譜檢測及分析。iTRAQ實驗流程iTRAQ實驗流程。iTRAQ實驗結果示例1:提取各組蛋白質、定量并用胰酶酶切；2.各組肽段分別用4種iTRAQ試劑標記(例如對照組用iTRAQ117標記，其他3個實驗組分別用iTRAQ114,115,116標記)；3.標記好的各組樣本等量混合，液相分離和質譜分析.

4:不同樣本中蛋白質的差異表達可通過二級質譜中iTRAQ試劑的峰面積確定，如圖所示：與對照組相比，該蛋白在3個處理組(114-116)中的相對表達量較高。5.根據(jù)該肽段的二級質譜峰圖，結合數(shù)據(jù)庫檢索，得到蛋白的定性信息。iTRAQ實驗結果示例1:提取各組蛋白質、定量并用胰酶酶切案例1：人腦脊液（客戶文章未發(fā)表，資料僅供內部參考）實驗設計：1.客戶用ELISA方法檢測正常人與病患腦脊液中幾個細胞因子存在穩(wěn)定差異2.客戶提供4種不同患者腦脊液樣本進行iTRAQ檢測分析。3.首先對其中一例樣本進行SDS分析，可見腦脊液中存在高峰度蛋白。4.除去高峰度部分蛋白，其他條帶切膠合并酶切提取。（也可以使用商品化去除高峰度試劑盒，成本較高，效果也因人而異。）案例1：人腦脊液（客戶文章未發(fā)表，資料僅供內部參考）實驗設計結果4列樣本共鑒定到861個蛋白，其中ELISA檢測到的細胞因子也得到驗證結果4列樣本共鑒定到861個蛋白，其中ELISA檢測到的細胞4組結果兩兩比較，篩選1.2倍以上差異，4組結果兩兩比較，篩選1.2倍以上差異，數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)交蓋圖數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)交蓋圖數(shù)據(jù)分析GO富集分析通過生物信息學分析工具DAVID對鑒定蛋白進行GO（GeneOntology，詳細信息見網(wǎng)站：）功能注釋、功能富集分析及定位分析。（可按照客戶要求繪制餅圖等）數(shù)據(jù)分析GO富集分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析Pathway通路富集分析在生物體內，存在著大量的代謝、調控和信號轉導過程，這些過程往往形成一條條不同的通路（pathway），基于Pathway的分析有助于了解發(fā)生差異變化蛋白質所的生物學進程位置。KEGG是有關Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫（Kanehisa，2008），通過Pathway分析能確定蛋白質參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。通路富集結果：數(shù)據(jù)分析Pathway通路富集分析案例2。蜂王漿提取物對腫瘤細胞的影響實驗背景：客戶把從蜂王漿中提取到的一種化合物與人的腫瘤細胞共同培養(yǎng)，觀察到其抑制了腫瘤細胞的遷移侵襲能力。由此猜想，此化合物有抑制腫瘤生長的作用。實驗設計：對照組（2重復），模型組（3重復），給藥組（3重復）實驗過程：8組樣本分別提取總蛋白定量，酶切后標記混合。之后進行液相粗分離，最后QE質譜檢測。實驗結果：蛋白序列數(shù)據(jù)庫來源:人類UniProt數(shù)據(jù)庫。質譜數(shù)據(jù)搜索采用PD搜索引擎共鑒定到蛋白4565個。差異蛋白分組進行比較。（判斷實驗成功與否的標準為鑒定到的總蛋白數(shù)是否達到文獻水平，差異蛋白數(shù)與實驗設計相關，無法承諾。）標記樣品組113實驗組1（對照）114實驗組1（對照）115實驗組2116實驗組2117實驗組2118實驗組3119實驗組3121實驗組3案例2。蜂王漿提取物對腫瘤細胞的影響實驗背景：客戶把從蜂王漿數(shù)據(jù)分析采用DAVID在線工具對顯著差異表達蛋白進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。（PAHTWAY無顯著富集）數(shù)據(jù)分析采用DAVID在線工具對顯著差異表達蛋白進行GO功能客戶關注的信號通路（pathway）客戶關注的信號通路（pathway）iTRAQ定量蛋白質組學課件iTRAQ定量蛋白質組學課件

差異表達蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

利用MetaCore軟件，對所有顯著差異表達蛋白進行相互作用網(wǎng)絡分析，。相互作用網(wǎng)絡分析顯示，差異表達蛋白富集到30條經(jīng)典子網(wǎng)絡，右為包含“SP1,TRAP230,Neprilysin,MIF,SLC38A2”等關鍵節(jié)點的子網(wǎng)。 差異表達蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

利用MetaCore軟件，對總結總結：iTRAQ技術及后期分析可以幫助客戶很好地驗證試驗猜想，以及為揭示蛋白表達變化原因提供可靠的方向指引。總結總結：iTRAQ技術及后期分析可以幫助客戶很好地驗證試驗高階（客制化）信息分析詳見信息分析PDF高階（客制化）信息分析詳見信息分析PDFiTRAQ詳細實驗步驟—ABI試劑盒iTRAQ詳細實驗步驟—ABI試劑盒iTRAQ詳細實驗步驟1：蛋白質提取

可以選擇提取蛋白質常用的各種溶液，裂解液里最好不要包括下面試劑，因為這些試劑會干擾iTRAQ試劑的標記反應。iTRAQ詳細實驗步驟1：蛋白質提取iTRAQ定量蛋白質組學課件iTRAQ定量蛋白質組學課件iTRAQ詳細實驗步驟2：蛋白質定量

(1)可以采用Bradford方法及其他方法定量初步

(2)定量取各組樣本的蛋白質進行SDS-APGE電泳，銀染定量，根據(jù)每個涌道染色情況微調蛋白濃度，保證后續(xù)實驗中每組樣本的蛋白量相同。iTRAQ詳細實驗步驟2：蛋白質定量iTRAQ詳細實驗步驟3：酶切，標記每組樣本（各100μg）分別加入-20℃預冷的丙酮（丙酮：樣品體積比=6：1），顛倒混勻，-20℃沉淀30min~4h（根據(jù)樣品所需沉淀量選擇時間，一般開始時可選1小時）；12000rpm離心15分鐘，棄上清，用試劑盒中自帶的溶解液dissolutionbuffer（20μL）和1%SDS(1μL)充分混懸溶解樣品；加入還原試劑2μL，混勻，60℃反應1h；加入半胱氨酸封閉試劑（cystineblockingregent）1μL,室溫處理10分鐘；按照酶：蛋白質=1：20的比例加入trypsin酶,37℃酶解過夜（16h）；113,114,115,116,117,118,119,121各管標記試劑中加入50μL異丙醇(試劑盒中自帶），混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應1h，之后各加入3倍體積的水，使標記試劑分解。標記和樣品對應關系如下:4R—117,未知—118，BOO6—119,11R—121；合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥。iTRAQ詳細實驗步驟3：酶切，標記iTRAQ詳細實驗步驟4：除鹽，此步操作是將標記過程中的標記試劑和相關buffer的鹽除去，以便于后續(xù)分析。（1）100%乙腈沖洗柱子3次（2）0.1%TFA(水溶),沖洗柱子三次（3）用400uL0.1%TFA溶解樣品，加載到柱子上（4）0.1%TFA沖洗柱子3~5次（5）用50%乙腈0.1%TFA400μL洗脫下樣品（6）將樣品冷凍干燥后進行后續(xù)分析。iTRAQ詳細實驗步驟4：除鹽，此步操作是將標記過程中的標iTRAQ詳細實驗步驟5:

第一維強陽離子柱(SCX)分離（1）儀器及試劑：<1>色譜儀20AD(島津)<2>真空離心濃縮機(ChristRVC2-25，Christ，Germany)

<3>磷酸二氫鉀(國藥集團)

<4>氯化鉀(國藥集團)

<5>乙腈ACN(Fisher)（2）具體操作參數(shù)柱子信息：Polysulfoethylcolumn,2.1mm*100mm,5u,200A,TheNestGroup,Inc.MAA相：10mMKH2PO4，25%CAN，PH2.6B相：10mMKH2PO4，350mMKCl，25%ACN，PH2.6

紫外檢測波長：214nm/280nm

流速：200μL/min

梯度：60miniTRAQ詳細實驗步驟5:第一維強陽離子柱(SCX)分離B%從5分鐘5%到40分鐘上升至25%Time(min)B%0 05 540254580508051060stop根據(jù)峰型和時間共收取20個梯度,真空離心濃縮后，用50μLRPLCA相[5%ACN,0.1%甲酸(TEDIA,Fairfield,USA)]溶解，進行第二維分析。B%從5分鐘5%到40分鐘上升至25%iTRAQ詳細實驗步驟6:

第二維反相液質聯(lián)用RPLC-MS（1）儀器及試劑<1>色譜儀20AD(島津)<2>質譜儀QSTARXL（AppliedBiosystem,USA）<3>乙腈ACN(Fisher)<4>甲酸（TEDIA）（2）具體操作參數(shù)反相柱信息：ZORBAX300SB-C18column(5μm,300A,0.1x150mm，microm,USA)

色譜分離90min，梯度B%從5分鐘5%到70分鐘上升至35%。A相：5%ACN,0.1%甲酸

B相：95%ACN,0.1%甲酸流速：300nL/miniTRAQ詳細實驗步驟6:第二維反相液質聯(lián)用RPLC-MS

Time(min)B%55%9035%9580%10080%1055%120stop質譜鑒定：MS掃描范圍400-1800MS/MS掃描范圍100-2000IDA采集模式一個圖譜選擇四個最強的母離子進行串級掃描。Time(min)B%iTRAQ詳細實驗步驟7:

數(shù)據(jù)檢索iTRAQ的質譜分析是由ThermoQ-Exactive型質譜完成，產(chǎn)生的質譜原始文件采用Thermo公司的配套商用軟件ProteomeDiscoverer1.3處理。iTRAQ詳細實驗步驟7:數(shù)據(jù)檢索THANKS!THANKS!iTRAQ定量蛋白質組學iTRAQ定量蛋白質組學主要內容iTRAQ技術簡介iTRAQ試劑標記原理iTRAQ技術優(yōu)勢iTRAQ實驗流程iTRAQ實驗結果示例iTRAQ實驗詳細步驟主要內容iTRAQ技術簡介iTRAQ技術簡介iTRAQ技術是由美國應用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystemsIncorporation，ABI)2004年開發(fā)的同重標簽標記的相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技術。iTRAQ試劑是可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側鏈氨基）連接的胺標記同重元素。在一級質譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記不同樣本中的同一蛋白質表現(xiàn)為相同的質荷比。在一級質譜中，不同來源的相同肽段表現(xiàn)為一個峰；在二級質譜中，iTRAQ試劑中的平衡基團發(fā)生中性丟失，信號離子表現(xiàn)為不同質荷比(114～121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達差異；同時，肽段的MS/MS結果結合數(shù)據(jù)庫檢索可以鑒定出相應的蛋白種類。iTRAQ技術簡介iTRAQ技43NCBI截止現(xiàn)在為1773篇4NCBI截止現(xiàn)在為1773篇44相關雜志對重復性要求5相關雜志對重復性要求※首選2-3次生物重復，最好3次或以上組內樣品個體差異大的材料需要更多的生物重復生物學重復樣品較多時，可以適當混合以減少樣品數(shù)目無任何重復，可以結合其他技術進行驗證45建議※首選2-3次生物重復，最好3次或以上6建議iTRAQ試劑標記原理報告部分共有8種：質量數(shù)分別為114~121Da，因此iTRAQ最多可同時標記8組樣品（客戶可按需選擇標記個數(shù)）。肽反應部分：能與肽鏈N端及賴氨酸側鏈發(fā)生共價連接，從而將報告部分和平衡部位標記到肽段上，幾乎可以標記所有蛋白質。平衡部分：質量數(shù)分別為31~24Da，與報告部分相互配合，保證iTRAQ試劑標記的不同樣本的同一肽段具有相同的質荷比。iTRAQ試劑標記原理報告部分共有8種：質量數(shù)分別為114圖1iTRAQ技術原理圖圖1iTRAQ技術原理圖iTRAQ技術優(yōu)勢靈敏度高：可檢測出低豐度蛋白；分離能力強:可分離出酸/堿性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等；適用范圍廣：可以對任何類型的蛋白質進行鑒定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：可同時對8個樣本進行分析，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析；結果可靠：定性與定量同步進行，同時給出每一個組分的相對表達水平、分子量和豐富的結構信息；自動化程度高：液質連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。iTRAQ技術優(yōu)勢靈敏度高：可檢測出低豐度蛋白；iTRAQ實驗流程iTRAQ實驗流程。

1：收集不同組別的樣本并分別提取蛋白質；

2：蛋白質經(jīng)過還原，封閉后用胰蛋白酶酶切；

3：各組樣本的肽段混合物分別用不同的iTRAQ試劑標記；

4：等量混合各樣本中的標記肽段；

5：MS/MS質譜檢測及分析。iTRAQ實驗流程iTRAQ實驗流程。iTRAQ實驗結果示例1:提取各組蛋白質、定量并用胰酶酶切；2.各組肽段分別用4種iTRAQ試劑標記(例如對照組用iTRAQ117標記，其他3個實驗組分別用iTRAQ114,115,116標記)；3.標記好的各組樣本等量混合，液相分離和質譜分析.

4:不同樣本中蛋白質的差異表達可通過二級質譜中iTRAQ試劑的峰面積確定，如圖所示：與對照組相比，該蛋白在3個處理組(114-116)中的相對表達量較高。5.根據(jù)該肽段的二級質譜峰圖，結合數(shù)據(jù)庫檢索，得到蛋白的定性信息。iTRAQ實驗結果示例1:提取各組蛋白質、定量并用胰酶酶切案例1：人腦脊液（客戶文章未發(fā)表，資料僅供內部參考）實驗設計：1.客戶用ELISA方法檢測正常人與病患腦脊液中幾個細胞因子存在穩(wěn)定差異2.客戶提供4種不同患者腦脊液樣本進行iTRAQ檢測分析。3.首先對其中一例樣本進行SDS分析，可見腦脊液中存在高峰度蛋白。4.除去高峰度部分蛋白，其他條帶切膠合并酶切提取。（也可以使用商品化去除高峰度試劑盒，成本較高，效果也因人而異。）案例1：人腦脊液（客戶文章未發(fā)表，資料僅供內部參考）實驗設計結果4列樣本共鑒定到861個蛋白，其中ELISA檢測到的細胞因子也得到驗證結果4列樣本共鑒定到861個蛋白，其中ELISA檢測到的細胞4組結果兩兩比較，篩選1.2倍以上差異，4組結果兩兩比較，篩選1.2倍以上差異，數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)交蓋圖數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)交蓋圖數(shù)據(jù)分析GO富集分析通過生物信息學分析工具DAVID對鑒定蛋白進行GO（GeneOntology，詳細信息見網(wǎng)站：）功能注釋、功能富集分析及定位分析。（可按照客戶要求繪制餅圖等）數(shù)據(jù)分析GO富集分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析Pathway通路富集分析在生物體內，存在著大量的代謝、調控和信號轉導過程，這些過程往往形成一條條不同的通路（pathway），基于Pathway的分析有助于了解發(fā)生差異變化蛋白質所的生物學進程位置。KEGG是有關Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫（Kanehisa，2008），通過Pathway分析能確定蛋白質參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。通路富集結果：數(shù)據(jù)分析Pathway通路富集分析案例2。蜂王漿提取物對腫瘤細胞的影響實驗背景：客戶把從蜂王漿中提取到的一種化合物與人的腫瘤細胞共同培養(yǎng)，觀察到其抑制了腫瘤細胞的遷移侵襲能力。由此猜想，此化合物有抑制腫瘤生長的作用。實驗設計：對照組（2重復），模型組（3重復），給藥組（3重復）實驗過程：8組樣本分別提取總蛋白定量，酶切后標記混合。之后進行液相粗分離，最后QE質譜檢測。實驗結果：蛋白序列數(shù)據(jù)庫來源:人類UniProt數(shù)據(jù)庫。質譜數(shù)據(jù)搜索采用PD搜索引擎共鑒定到蛋白4565個。差異蛋白分組進行比較。（判斷實驗成功與否的標準為鑒定到的總蛋白數(shù)是否達到文獻水平，差異蛋白數(shù)與實驗設計相關，無法承諾。）標記樣品組113實驗組1（對照）114實驗組1（對照）115實驗組2116實驗組2117實驗組2118實驗組3119實驗組3121實驗組3案例2。蜂王漿提取物對腫瘤細胞的影響實驗背景：客戶把從蜂王漿數(shù)據(jù)分析采用DAVID在線工具對顯著差異表達蛋白進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。（PAHTWAY無顯著富集）數(shù)據(jù)分析采用DAVID在線工具對顯著差異表達蛋白進行GO功能客戶關注的信號通路（pathway）客戶關注的信號通路（pathway）iTRAQ定量蛋白質組學課件iTRAQ定量蛋白質組學課件

差異表達蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

利用MetaCore軟件，對所有顯著差異表達蛋白進行相互作用網(wǎng)絡分析，。相互作用網(wǎng)絡分析顯示，差異表達蛋白富集到30條經(jīng)典子網(wǎng)絡，右為包含“SP1,TRAP230,Neprilysin,MIF,SLC38A2”等關鍵節(jié)點的子網(wǎng)。 差異表達蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

利用MetaCore軟件，對總結總結：iTRAQ技術及后期分析可以幫助客戶很好地驗證試驗猜想，以及為揭示蛋白表達變化原因提供可靠的方向指引?？偨Y總結：iTRAQ技術及后期分析可以幫助客戶很好地驗證試驗高階（客制化）信息分析詳見信息分析PDF高階（客制化）信息分析詳見信息分析PDFiTRAQ詳細實驗步驟—ABI試劑盒iTRAQ詳細實驗步驟—ABI試劑盒iTRAQ詳細實驗步驟1：蛋白質提取

可以選擇提取蛋白質常用的各種溶液，裂解液里最好不要包括下面試劑，因為這些試劑會干擾iTRAQ試劑的標記反應。iTRAQ詳細實驗步驟1：蛋白質提取iTRAQ定量蛋白質組學課件iTRAQ定量蛋白質組學課件iTRAQ詳細實驗步驟2：蛋白質定量

(1)可以采用Bradford方法及其他方法定量初步

(2)定量取各組樣本的蛋白質進行SDS-APGE電泳，銀染定量，根據(jù)每個涌道染色情況微調蛋白濃度，保證后續(xù)實驗中每組樣本的蛋白量相同。iTRAQ詳細實驗步驟2：蛋白質定量iTRAQ詳細實驗步驟3：酶切，標記每組樣本（各100μg）分別加入-20℃預冷的丙酮（丙酮：樣品體積比=6：1），顛倒混勻，-20℃沉淀30min~4h（根據(jù)樣品所需沉淀量選擇時間，一般開始時可選1小時）；12000rpm離心15分鐘，棄上清，用試劑盒中自帶的溶解液dissolutionbuffer（20μL）和1%SDS(1μL)充分混懸溶解樣品；加入還原試劑2μL，混勻，60℃反應1h；加入半胱氨酸封閉試劑（cystineblockingregent）1μL,室溫處理10分鐘；按照酶：蛋白質=1：20的比例加入trypsin酶,37℃酶解過夜（16h）；113,114,115,116,117,118,119,121各管標記試劑中加入50μL異丙醇(試劑盒中自帶），混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應1h，之后各加入3倍體積的水，使標記試劑分解。標記和樣品對應關系如下:4R—117,未知—118，BOO6—119,11R—121；合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥。iTRAQ詳細實驗步驟3：酶切，標記iTRAQ詳細實驗步驟4：除鹽，此步操作是將標記過程中的標記試劑和相關buffer的鹽除去，以便于后續(xù)分析。（1）100%乙腈沖洗柱子3次（2）0.1%TFA(水溶),沖洗柱子三次（3）用400uL0.1%TFA溶解樣品，加載到柱子上（4）0.1%TFA沖洗柱子3~5次（5）用50%乙腈0.1%TFA400μL洗脫下樣品（6）將樣品冷凍干燥后進行后續(xù)分析。iTRAQ詳細實驗步驟4：除鹽，此步操作是將標記過程中的標iTRAQ詳細實驗步驟5:

第一維強陽離子柱(SCX)分離（1）儀器及試劑：<1>色譜儀20AD(島津)<2>真空離心濃縮機(ChristRVC2-25，Christ，Germany)

<3>磷酸二氫鉀(國藥集團)

<4>氯化鉀(國藥集團)

<5>乙腈ACN(Fisher)（2）具體操作參數(shù)柱子信息：Polysulfoethylcolumn,2.1mm*100mm,5u,200A,TheNestGroup,Inc.MAA相：10mMKH2PO4，25%CAN，PH2.6B相：10mMKH2PO4，350mMKCl，25%ACN，PH2.6

紫外檢測波長：214nm/280nm

流速：200μL/min