滅菌法標準操作規(guī)程1簡述凡能殺滅物體中所有活的微生物的作用稱為滅菌。滅菌的手段及設備，分別稱為滅菌法及滅菌器。確切地講，滅菌法系指用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W手段將物品中活的微生物殺滅或除去，從而使物品殘存活微生物的概率下降至預期的無菌保證水平的方法。本法適用于制劑、原料、輔料及醫(yī)療器械等物品的滅菌。最終滅菌的物品微生物存活概率，即無菌保證水平不得高于 10戈物品的無菌保證水平與滅菌工藝、滅菌前物品被污染的程度及污染菌的特性相關。已滅菌物品達到的無菌保證水平可通過驗證確定。常用的滅菌方法有濕熱滅菌法、干熱滅茵法、輻射滅菌法、氣體滅菌法和過濾除菌法?？筛鶕?jù)被滅菌物品的特性采用一種或多種方法組合滅菌。在藥品檢驗工作中，無論采用何種滅菌方法，都應考慮到原有成分的穩(wěn)定性和安全性，對滅菌條件除要求滅菌完全之外，還必須保證被滅菌物質成分不被破壞，不影響物品的質量。2滅菌方法濕熱滅菌法本法系指將物品置于滅菌柜內利用高壓飽和蒸汽、過熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質、核酸發(fā)生變性而殺滅微生物的方法。濕熱滅菌包括煮沸、巴氏消毒、流通蒸汽和高壓蒸汽滅菌等。濕熱滅菌條件的選擇應考慮滅菌物品的熱穩(wěn)定性、熱穿透力、微生物污染程度等因素。煮沸、巴氏消毒、流通蒸汽不能有效殺滅細菌抱子，一般可作為不耐熱無菌產品的輔助滅菌手段。高壓蒸汽滅菌滅菌能力強，為熱力滅菌中最有效、應用最廣泛的滅菌方法。適用范圍藥品、容器、培養(yǎng)基、無菌衣、膠塞以及其他遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損壞的物品，均可采用本法滅菌。不能用于凡士林等油類和粉劑的滅菌。2.1.2壓力蒸汽滅菌器根據(jù)排放冷空氣的方式和程度不同，分為下排氣式壓力蒸汽滅菌器和預真空壓力蒸汽滅菌器二大類。下排氣式壓力蒸汽滅菌器利用重力置換原理，使熱蒸汽在滅菌器中從上而下，將冷空氣由下排氣孔排出，排出的冷空氣由飽和蒸汽取代，利用蒸汽釋放的潛熱使物品達到滅菌。預真空壓力蒸汽滅菌器利用機械抽真空的方法，使滅菌柜室內形成負壓，蒸汽得以迅速穿透到物品內部進行滅菌。蒸汽壓力達205.8kPa(2.1kg/cm2)，溫度達132℃或以上，開始滅菌，到達滅菌時間后，抽真空使滅菌物品迅速干燥。根據(jù)一次性或多次抽真空的不同，分為預真空和脈動真空二種，后者因多次抽真空，空氣排除更徹底，效果更可靠。壓力蒸汽滅菌器的使用具體操作步驟、常規(guī)保養(yǎng)和檢查措施，應按照廠方說明書的要求嚴格執(zhí)行。2.1.3滅菌前物品的準備清洗：滅菌前應將物品徹底清洗干凈，物品洗滌后，應干燥并及時包裝。包裝包裝材料應允許物品內部空氣的排出和蒸汽的透入。 市售普通鋁飯盒與搪瓷盒，不得用于裝放待滅菌的物品，應用自動啟閉式或帶氣孔的器具裝放；物品捆扎不宜過緊，外用化學指示膠帶貼封，滅菌包每大包內和難滅菌部位的包內放置化學指示物。裝載(1)下排氣滅菌器的裝載量不得超過柜室內容量的80%；預真空滅菌器的裝載量不得超過柜室內容量的90%，同時預真空和脈動真空壓力蒸汽滅菌器的裝載量又分別不得小于柜室容積的10%和5%,以防止“小裝量效應”，殘留空氣影響滅菌效果。(2)應盡量將同類物品放在一起滅菌，若必須將不同類物品裝放在一起，則以最難達到滅菌物品所需的溫度和時間為準。(3)物品裝放時，上下左右相互間均應間隔一定距離以利蒸汽置換空氣；大型滅菌器，物品應放于柜室或推車上的鐵絲網(wǎng)擱架上；無擱架的中小型滅菌器，可將物品放于鐵絲藍中。(4)難于滅菌的大包放在上層，較易滅菌的小包放在下層；金屬物品放下層，織物包房上層，物品裝放不能貼靠門和四壁，以防吸入較多的冷凝水。(5)啟閉式篩孔容器，應將篩孔的蓋打開。滅菌后處理檢查化學指示膠帶(指示卡)變色情況，未達到或有可疑點者，不可使用；2.1.4.2已滅菌的物品，不得與未滅菌物品混放；合格的滅菌物品，應標明滅菌日期；每批滅菌處理完成后，應記錄滅菌物品的種類、滅菌溫度、作用時間和滅菌日期與操作者等。有溫度，時間記錄裝置的，應將記錄紙歸檔備查；注意事項采用濕熱滅菌時，被滅菌物品應有適當?shù)难b載方式，不能排列過密，以保證滅菌的有效性和均一性。濕熱滅菌法應確認滅菌柜在不同裝載時可最存在芝給點。當用生物指示劑進一步確認滅菌效果時，應將其置于冷點處。完全排出高壓滅菌器內的冷空氣。在高壓蒸汽滅菌時，為保證達到規(guī)定的溫度，必須將冷空氣完全排出。否則，雖然壓力達到，而溫度達不到規(guī)定的要求，滅菌就不徹底。要注意被滅菌物品的溫度。滅菌器內溫度與被滅菌藥品溫度之間的關系：兩者之間的溫度一般是一致的，但亦有不一致之時。不一致的情況多發(fā)生于蒸汽輸入過快而溫度上升較慢。高壓蒸汽滅菌的物品取出時切勿立即置冷處，避免因急速冷卻，使滅菌物品內蒸汽冷凝造成負壓，易染菌，取出后應置恒溫培養(yǎng)箱中(或干燥箱)中烘干，待用。2.1.5.6滅菌設備應在使用時每日檢查一次，檢查內容包括：(1)檢查門框與橡膠墊圈有無損壞、是否平整、門的鎖扣是否靈活、有效。(2)檢查壓力表在蒸汽排盡時是否到達零位。（3）由柜室排氣口倒入500ml水，查有無阻塞。（4）關好門，通蒸汽檢查是否存在泄漏。（5）檢查蒸汽調節(jié)閥是否靈活、準確、壓力表與溫度計所標示的狀況是否吻合，排氣口溫度計是否完好。（6）檢查安全閥是否在蒸汽壓力達到規(guī)定的安全限度時被沖開。（7）手提式和立式壓力蒸汽滅菌器主體與頂蓋必須無裂縫和變形；無排氣軟管或軟管銹蝕的手提式壓力蒸汽滅菌器不得使用。（8）臥式壓力蒸汽滅菌器輸入蒸汽的壓力不宜過高，夾層的溫度不能高于滅菌室的溫度。⑼預真空和脈動狀況壓力蒸汽滅菌器每日進行一次B-D測試，檢測它們的空氣排除效果。干熱滅茵法本法系指將物品置于干熱滅菌柜、隧道滅菌器等設備中，利用干熱空氣達到殺滅微生物或消除熱原物質的方法。適用范圍適用于耐高溫但不宜用濕熱滅菌法滅茵物品的滅茵，如玻璃器具、金屬制容器、纖維制品、固體試藥、液狀石蠟等均可采用本法滅菌。操作方法灼燒與火焰滅菌：灼燒主要是用于接種工具滅菌，如接種針、刀、剪等在火焰上燒灼即可達到徹底滅菌，火焰滅菌通常用于無菌操作中，將試管口、玻璃瓶口、硅氟塑料塞等反復通過火焰數(shù)次，利用火焰對管口等進行滅菌，阻止管口污染，作為無菌操作過程中的輔助滅菌手段，故其效果與灼燒滅菌并不完全等同。但燒灼對器材損壞性大。此外，污染的紙張、棉花和實驗動物的尸體等等可用焚燒滅菌。干烤滅菌：利用熱輻射及干熱空氣進行滅菌，多采用機械對流型烤箱。一般將待滅菌的物品，例如剪刀、鑷子、不銹鋼藥匙、注射器、平皿、試管、乳缽等金屬、玻璃、陶瓷制品包裝后均可在烤箱內干熱滅菌。通常加熱至160℃，保溫2h可完全滅菌。250℃X45min的干熱滅菌也可除去無菌產品包裝容器及有關生產灌裝用具中的熱原物質。細菌內毒素滅活驗證試驗是證明除熱原過程有效性的試驗。一般將不小于1000單位的細菌內毒素加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內毒素至少下降3個對數(shù)單位。注意事項待滅菌的物品干熱滅菌前應洗凈，防止造成滅菌失敗或污物炭化；玻璃器皿滅菌前應洗凈；滅菌時勿語烤箱底部及四壁接觸，滅菌后不宜降溫過速，驟冷易引起玻璃器皿炸裂。采用干熱滅菌時，被滅菌物品應有適當?shù)难b載方式，不能排列過密，以保證滅菌的有效性和均一性。物品包裝不能過大，物品不能超過烤箱高度的2/3，物品間應留有充分的空間（可放入一只手）。溫度不宜超過170℃,因包裝用紙張或棉織物容易焦化，玻璃量具也易變形。干熱滅菌法應確認滅菌柜中的溫度分布符合設定的標準及確定最冷點位置等。輻射滅茵法本法系指將物品置于適宜放射源輻射的Y射線或適宜的電子加速器發(fā)生的電子束中進行電離輻射而達到殺滅微生物的方法。最常用的為 6oCO-Y射線輻射滅菌。醫(yī)療器械、容器、生產輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等均可用本法滅菌。但因安全性原因，6oCO-Y射線輻射滅菌在實驗室應用較少。紫外線是光譜中對生物危害最大的部分，亦是一種電磁輻射。它使 DNA的喀啶基之間產生交聯(lián)，成為二聚物，抑制DNA的復制，導致突變或死亡。細菌芽抱較繁殖體對紫外線有較強的抗性。紫外線消毒操作方便，殺菌譜廣，但穿透力弱，影響因素多，殺菌效能受到一定限制。紫外線消毒適用范圍及條件微生物污染的表面、水和空氣均可采用紫外線消毒。消毒時必須使消毒部位充分暴露于紫外線。用紫外線消毒紙張、織物等粗糙表面時，要適當延長照射時間，且兩面均應受到照射。紫外線消毒的適宜溫度范圍是20?40℃，溫度過高過低均會影響消毒效果，可適當延長消毒時間；用于空氣消毒時，消毒環(huán)境的相對濕度應低于80%,否則應適當延長照射時間。用紫外線殺滅被有機物保護的微生物時，應加大照射劑量?？諝夂退械膽腋×Ｗ右部捎绊懴拘Ч?。紫外線消毒燈和紫外線消毒器目前我國使用的紫外線消毒燈油下述幾種：(1)普通直管熱陰極低壓汞紫外線消毒燈：由于這種燈在輻射 253.7nm紫外線的同時，也輻射一部分184.9nm紫外線，故可產生臭氧。(2)高強度紫外線消毒燈：要求輻射253.7nm紫外線的強度(在距離1m處測定)：功率30W燈，＞170uW/cm2；11W燈，＞40uW/cm2.⑶低臭氧紫外線消毒燈：熱陰極低壓汞燈，可為直管型或H型，由于采用了特殊工藝和燈管材料，故臭氧產量很低，要求采用產量＜ 1mg/h。(4)高臭氧紫外線消毒燈：由于采取了同時工藝，這種燈產生較大比例的波長184.9nm的紫外線，故臭氧產量較大。紫外線消毒器(1)紫外線空氣消毒器：采用低臭氧紫外線殺菌燈制造，可用于有人條件下的室內空氣消毒。(2)紫外線表面消毒器：采用低臭氧高強度紫外線殺菌燈制造，以使其能快速達到滿意的消毒效果。(3)紫外線消毒箱：采用高臭氧強度紫外線殺菌燈或直管高臭氧紫外線燈制造，利用紫外線和臭氧的協(xié)同殺菌作用，同時利用臭氧對紫外線照射不到的部位進行消毒。紫外線消毒使用方法對物品表面的消毒：(1)照射方式：最好使用便攜式紫外線消毒器近距離移動照射，也可采取作為紫外燈懸吊式照射，對小件物品可放紫外線消毒箱內照射。(2)照射劑量和時間：不同種類的微生物對紫外線的敏感度不同，用紫外線消毒時必須使用照射劑量達到目標微生物所需的照射劑量。殺滅一般細菌繁殖體時，應使照射劑量達到10000uW。s/cm2；殺滅細菌芽抱時應達到10000uW。s/cm2；病毒對紫外線的抵抗力介于細菌繁殖體和芽抱之間；真菌抱子的抵抗力比細菌一般更強，有時 需要照射到600000uW。s/cm2，但一般致病性真菌對紫外線的抵抗力比細菌一般弱；在消毒的目標微生物不詳時，照射劑量不應低于100000UW。s/cm2。輻射劑量是所用紫外線燈在照射物品表面處的輻射強度和照射時間的乘積。因此，根據(jù)紫外線光源的輻照強度，可用計算出需要照射的時間。例如，用輻照強度 70uW/cm2的紫外線表面消毒器近距離照射物品表面，選擇的輻照劑量是 100000UW。s/cm2，則需照射的時間是：100000UW。s/cm2+70uW/cm2=1429也24min對室內空氣的消毒(1)間接照射法：首選高強度紫外線空氣消毒器，不僅消毒效果可靠，而且可在室內有人活動時使用，一般開機消毒30min即可達到消毒合格。(2)直接照射法：在室內無人條件下，可采取紫外線燈懸吊式或移動式直接照射。采用室內懸吊式紫外線消毒時，室內安裝紫外線消毒燈(30W紫外燈，在1.0m處的強度〉70uW/cm2)的數(shù)量為平均每立方米不少于1.5W，照射時間不少于30min。注意事項要求用于消毒的紫外線燈在電壓為220V、環(huán)境相對濕度為60%、溫度為20℃時，輻射的253.7nm紫外線強度(使用中的強度)不得低于70uW/cm2，測定的距離：普通30W直管紫外線燈在距燈管1m處測定，特殊紫外線燈在使用距離處測定：使用的紫外線測強儀必須經過標定，且在有效期內；使用的紫外線強度檢測指示卡，應取得衛(wèi)生許可批件，并在有效期內使用。紫外線燈使用過程中其輻照強度逐漸降低，故應定期測定消毒紫外線的強度，一旦降到要求的強度以下時，應及時更換。在使用過程中，應保持紫外線燈表面的清潔，一般每兩周用酒精棉球擦拭一次，發(fā)現(xiàn)燈管表面有灰塵、油污時，應隨時擦拭。用紫外線燈終點室內空氣時，房間內應保持清潔干燥，減少塵埃和水霧，溫度低于20℃或高于40℃,相對濕度大于60%時應適當延長照射時間。用紫外線消毒物品表面時，應使照射表面受到紫外線的直接照射，且應達到足夠的照射劑量。不得使紫外線光源照射到人，以免引起損傷。紫外線強度計至少一年標定一次。氣體滅茵法本法系指用化學消毒劑形成的氣體殺滅微生物的方法。常用的化學消毒劑有環(huán)氧乙烷、氣態(tài)過氧化氫、甲醛、臭氧(0,)等，本法適用于在氣體中穩(wěn)定的物品滅菌。采用氣體滅菌法時，應注意滅菌氣體的可燃可爆性、致畸性和殘留毒性。本法中最常用的氣體是環(huán)氧乙烷，一般與80%~90%的惰性氣體混合使用，在充有滅菌氣體的高壓腔室內進行。該法可用于醫(yī)療器械，塑料制品等不能采用高溫滅菌的物品滅菌。含氯的物品及能吸附環(huán)氧乙烷的物品則不宜使用。采用環(huán)氧乙烷滅菌時，滅茵柜內的溫度、濕度、滅菌氣體濃度、滅菌時間是影響滅菌效果的重要因素。可采用下列滅菌條件：溫度54℃土10℃相對濕度60%士10%滅菌壓力8XI05Pa滅菌時間9Omin滅茵條件應予驗證。滅菌時，將滅菌腔室抽成真空，然后通人蒸汽使腔室內達到設定的溫濕度平衡的額定值，再通入經過濾和預熱的環(huán)氧乙烷氣體。滅菌過程中，應嚴密監(jiān)控腔室的溫度、濕度、壓力、環(huán)氧乙烷濃度及滅菌時間。必要時使用生物指示劑監(jiān)控滅菌效果。本法滅菌程序的控制具有一定難度，整個滅菌過程應在技術熟練人員的監(jiān)督下進行。滅菌后.應采取新鮮空氣置換，使殘留環(huán)氧乙烷和其他易揮發(fā)性殘留物消散。并對滅菌物品中的環(huán)氧乙烷殘留物和反應產物進行監(jiān)控，以證明其不超過規(guī)定的濃度，避免產生毒性。采用環(huán)氧乙烷滅菌時，應進行泄漏試驗，以確認滅菌腔室的密閉性。滅菌程序確認時，還應考慮物品包裝材料和滅菌腔室中物品的排列方式對滅菌氣體的擴散和滲透的影響。過濾除菌法本法系利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。常用于氣體、熱不穩(wěn)定的藥品溶液或原料的除菌。除菌過濾器采用孔徑分布均勻的微孔濾膜作過濾材料，微孔濾膜分親水性和疏水性兩種。濾膜材質依過濾物品的性質及過濾目的而定。除菌濾器及濾膜應符合《無菌檢查法標準操作規(guī)范》的要求。3生物指示劑生物指示劑系一類特殊的活微生物制品，可用于確認滅菌設備的性能、滅茵程序的驗證、生產過程滅茵效果的監(jiān)控等。用于滅菌驗證中的生物指示劑一般是細菌的抱子。制備生物指示劑用微生物的基本要求不同的滅菌方法使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物必須具備以下特性：菌種的耐受性應大于需滅菌產品中所有可能污染菌的耐受性。菌種應無致病性。菌株應穩(wěn)定。存活期長，易于保存。易于培養(yǎng)。若使用休眠抱子，生物指示劑中休眠抱子含量要在 90%以上。生物指示劑的制備生物指示劑的制備應按一定的程序進行，需先確定所用微生物的特性：如D值（微生物的耐熱參數(shù)，系指一定溫度下，將微生物殺滅90%所需的時間，以分表示）等。菌株應用適宜的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)物應制成懸浮液，其中抱子的數(shù)量應占優(yōu)勢，抱子應懸浮于無營養(yǎng)的液體中保存。生物指示劑中包含一定數(shù)量的一種或多種抱子，可制成多種形式，通常是將一定數(shù)量的抱子附著在惰性的載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等；抱子懸浮液也可密封于安甑中；有的生物指示劑還配有培養(yǎng)基系統(tǒng)。D值除與滅菌條件相關外，還與微生物存在的環(huán)境有關。因此，一定形式的生物指示劑制備完成后，應測定D值和于抱子總數(shù)。生物指示劑應選用合適的材料包裝，并設定有效期。載體和包裝材料在保護生物指示劑不致污染的同時，還應保證滅菌劑穿透并能與生物指示劑充分接觸。載體和包裝的設計原則是便于貯存、運輸、取樣、轉移接種。有些生物指示劑可直接將抱子接種至液體滅菌物或具有與其相似的物理和化學特性的替代品中。使用替代品時，應用數(shù)據(jù)證明二者的等效性。生命指示劑的應用在滅菌程序的驗證中，盡管可通過滅菌過程某些參數(shù)的監(jiān)控來評估滅菌效果，但生物指示劑的被殺滅程度，則是評價一個滅菌程序有效性最直觀的指標。可使用市售的標準生物指示劑，也可使用由日常生產污染菌監(jiān)控中分離的耐受性最強的微生物制備的抱子。在生物指示劑驗證試驗中，需確定抱子在實際滅離條件下的D值，并測定于抱子的純度和數(shù)量。驗證時，生物指示劑的微生物用量應比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強，以保證滅菌程序有更大的安全性。在最終滅菌法中，生物指示劑應放在滅菌柜的不同部位。并避免指示劑直接接觸被滅菌物品。生物指示劑按設定的條件滅菌后取出，分別置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定生物指示劑中的抱子是否被完全殺滅。過度殺滅產品滅菌驗證一般不考慮微生物污染水平，可采用市售的生物指示劑。對滅菌手段耐受性差的產品，設計滅菌程序時，根據(jù)經驗預計在該生物工藝中產品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和抱子數(shù)量。這類產品的無菌保證應通過監(jiān)控每批滅菌前的微生物污染的數(shù)量、耐受性和滅菌程序驗證所獲得的數(shù)據(jù)進行評估。常用生物指示劑濕熱滅菌法濕熱滅菌法最常用生物指示劑為嗜熱脂肪芽拖桿菌于抱子(SporesofBacillusstearothermophilus，如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)。D值為1.5-3.0min，每片(或每瓶)活抱子數(shù)5義10'-5X106個，在121°C、19min下應被完全殺滅。止匕外，還可使用生抱梭菌抱子(SporesofClostridiumsporogenes，如：CTC8594、:cnm8053、ATCC7955),D值為O.4-0.8min.干熱滅菌法干熱滅菌法最常用的生物指示劑為枯草芽抱桿菌抱子(SporesofBacillussuhtilis.如NICM8058、ATCC9372)。D值大于1.5min,每片活抱子數(shù)5X10,-5X106個。去熱原驗證時使用大腸埃希菌內毒素(Escherichiacoliendoxin)，加量不小于1000細菌內毒素單位。輻射滅菌法 輻射滅菌法最常用的生物指示劑為小芽抱桿菌抱子(SporesofBacilluspumilus，如NCTC10327、NCIMB10692、ATCC27142)。每片活抱子數(shù)10'?108,置于放射劑量25kGy條件下，D值約3kGy。但應注意滅