基因工程考試試題基因工程考試試題基因工程考試試題資料僅供參考文件編號：2022年4月基因工程考試試題版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：基因工程一名詞解釋

1、限制與修飾系統(tǒng)：限制酶的生物學(xué)功能一般被認(rèn)為是用來保護(hù)宿主細(xì)胞不受外源DNA的感染，可講解外來DNA，從而阻止其復(fù)制和整合到細(xì)胞中。一般來說，與限制酶相伴而生的修飾酶是甲基轉(zhuǎn)移酶，或者說是甲基化酶，能保護(hù)自身的DNA不被講解。限制酶和甲基轉(zhuǎn)移酶組成限制與修飾系統(tǒng)。2、各種限制與修飾系統(tǒng)的比較Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型識別位點(diǎn)4~6bp，大多為回文序列二分非對稱5~7bp非對稱切割位點(diǎn)在識別位點(diǎn)中或靠近識別位點(diǎn)無特異性，至少在識別位點(diǎn)外100bp識別位點(diǎn)下游24~26bp簡答1.何謂Staractivity簡述Staractivity的影響因素及克服方法答：在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個(gè)改變的特征稱為星星活性。引起星星活性的的因素：①高甘油濃度（>5%）；②酶過量（>100U/μl）；③低離子強(qiáng)度（<25mmol/L）；④高pH(>；⑤有機(jī)溶劑如DMSO（二甲基亞砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二價(jià)陽離子Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替Mg2+。星星活性的抑制措施：①減少酶的用量，避免過量酶切，減少甘油濃度；②保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶劑或乙醇；③提高離子強(qiáng)度到100～150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反應(yīng)pH至；⑤使用Mg2+作為二價(jià)陽離子。2.試回答影響限制性內(nèi)切核酸酶切割效率的因素（影響酶活性的因素）答：外因：反應(yīng)條件、底物純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽離子和苯酚的污染）、何時(shí)加酶、操作是否恰當(dāng)，反應(yīng)體系的選擇、反應(yīng)時(shí)間的長短內(nèi)因：星星活性、底物甲基化、底物的構(gòu)象3、DNA末端長度對酶切割的影響答：限制酶切割DNA時(shí)，對識別序列兩端的非識別序列有長度要求，也就是說在識別序列兩端必須要有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順利切割擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。一般需加3～4個(gè)堿基對。4、何為載體一個(gè)理想的載體應(yīng)具備那些特點(diǎn)答：將外源DNA或目的基因攜帶入宿主細(xì)胞的工具稱為載體。載體應(yīng)具備：①在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）；②必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制；③有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選；④其它：有一定的拷貝數(shù)，便于制備。5抗性基因（Resistantgene）是目前使用的最廣泛的選擇標(biāo)記，常用的抗生素抗性有哪幾種并舉兩例說明其原理答：氨芐青霉素抗性基因（ampr）、四環(huán)素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr,neor）以及琥珀突變抑制基因supF。⑴青霉素抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并抑制其活性。氨芐青霉素抗性Ampr編碼一個(gè)酶，可分泌進(jìn)入細(xì)胞的周質(zhì)區(qū)，并催化β-內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除氨芐青霉素的毒性。⑵四環(huán)素與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。Tetr編碼一個(gè)由399個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。6.何為α-互補(bǔ)如何利用α-互補(bǔ)來篩選插入了外源DNA的重組質(zhì)粒答：α-互補(bǔ)指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。α-互補(bǔ)是基于在兩個(gè)不同的缺陷β－半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而建立的。實(shí)現(xiàn)α-互補(bǔ)主要有兩部分組成：LacZ△M15，放在F質(zhì)?；蛉旧w上，隨宿主傳代；LacZ'，放在載體上，作為篩選標(biāo)記，當(dāng)在LacZ'中插入一個(gè)片斷后，將不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無α-互補(bǔ)能力的β－半乳糖苷酶片斷。在誘導(dǎo)物IPTG和底物X-gal（同時(shí)可作為生色劑）的作用下，含重組質(zhì)粒的菌落不能產(chǎn)生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解X-gal，呈現(xiàn)白色，而含非重組質(zhì)粒的菌落則呈現(xiàn)蘭色。以此達(dá)到篩選的目的。7、試簡述λ噬菌體的裂解生長狀態(tài)Lyticgrowth和溶原狀態(tài)Lysogenicstate兩種循環(huán)的分化及其調(diào)節(jié)過程答：裂解生長狀態(tài)是λ噬菌體在宿主中大量復(fù)制并組裝成子代λ噬菌體顆粒，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。溶原狀態(tài)為λ噬菌體基因組DNA通過位點(diǎn)專一性重組整合到宿主染色體DNA中隨宿主的繁殖傳到子代細(xì)胞。調(diào)節(jié)過程：由感染復(fù)數(shù)和細(xì)胞的營養(yǎng)狀態(tài)決定的，感染復(fù)數(shù)越高，營養(yǎng)狀態(tài)越差，則溶源化的頻率就越高。溶源現(xiàn)象的生化媒介可能是3'--5'cAMP，它在細(xì)胞內(nèi)的濃度會隨營養(yǎng)條件的變化而改變，當(dāng)細(xì)胞在富營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長時(shí)，cAMP的濃度較低，有利于裂解生長；在缺乏cAMP的突變細(xì)胞中，更有利于裂解生長另外一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因素是噬菌體的CⅡ蛋白，它是噬菌體基因轉(zhuǎn)錄的激活子，抑制裂解功能基因的表達(dá)，催化噬菌體DNA整合到細(xì)菌的染色體中去。高濃度的CⅡ蛋白促進(jìn)溶源化，而低濃度的CⅡ蛋白促進(jìn)裂解生長。當(dāng)CⅡ蛋白濃度足夠時(shí)，激活CⅠ蛋白和基因int的表達(dá)，導(dǎo)致噬菌體DNA與染色體整合，朝著溶源態(tài)生長。9、cDNA文庫的構(gòu)建：將來自真核生物的mRNA體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌的過程。⑴細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離⑵第一鏈合成：由mRNA到cDNA的過程為反轉(zhuǎn)錄，由反轉(zhuǎn)錄酶催化。⑶第二鏈合成：①自身引物合成法②置換合成法③引導(dǎo)合成法④引物—銜接頭合成法⑷雙鏈cDNA里連接到質(zhì)粒或噬菌體載體并導(dǎo)入大腸桿菌中繁殖10、文庫質(zhì)量檢測答：文庫質(zhì)量是由文庫所含克隆的數(shù)目、平均插入片段的長度、插入效率、基因組覆蓋度和覆蓋倍數(shù)等因素決定?？寺?shù)越多、平均插入片段的長度越長、插入效率和基因組覆蓋度越高，文庫質(zhì)量越好。克隆數(shù)目可以通過多次轉(zhuǎn)化累加，但并非越多越好，只要達(dá)到一定數(shù)目的基因組覆蓋倍數(shù)和覆蓋度就行，一般要求達(dá)到4—6倍覆蓋率。11、基因覆蓋倍數(shù)的估算方法答：有兩種，一：用公式計(jì)算基因組覆蓋倍數(shù)=平均插入片段的長度ⅹ克隆數(shù)/基因組DNA長度二：結(jié)合基因覆蓋度檢測來估算?；蚪M覆蓋度是指問苦衷克隆覆蓋基因組的范圍。即選擇一定數(shù)目的單拷貝基因作探針來篩選文庫。每個(gè)探針篩選的克隆數(shù)目，即為該基因位點(diǎn)的覆蓋倍數(shù)。12、解釋并計(jì)算N=ln(1-P)/ln(1-f)式中N：代表一個(gè)基因組文庫所包含重組克隆個(gè)數(shù)P：代表所期望的目的基因在文庫中出現(xiàn)的概率f：表示重組克隆平均插入片段的長度和基因組DNA長度的比值計(jì)算：大腸桿菌基因組大小約mb，若P=99%，平均插入片段大小為20kb，f=20kb/4600kb,則N=1057.即當(dāng)期望從一個(gè)平均插入片段為20kb的大腸桿菌基因組文庫中篩選到任意一個(gè)感興趣的基因的概率達(dá)99%，該基因文庫至少應(yīng)包含1057個(gè)重組克隆。選擇合適的載體系統(tǒng)和挑去一定的陽性克隆是構(gòu)建基因組文庫時(shí)首先考慮的問題。論述題1、cDNA文庫的均一化處理兩條途徑：基因組DNA飽和雜交法和基因組DNA飽和雜交法⑴基因組DNA飽和雜交法原理：利用不同表達(dá)水平的基因?qū)?yīng)的基因組拷貝數(shù)相對一致的特點(diǎn)，可以對cDNA文庫進(jìn)行均一化處理步驟①將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化固定，消化后的基因組DNA扁形為相對較短的單鏈且最大可能的覆蓋基因組。②分離純化獨(dú)立cDNA文庫的混合質(zhì)粒③文庫cDNA與固定的基因組DNA充分飽和雜交，固定住相應(yīng)的cDNA，并將它洗脫重新轉(zhuǎn)化受體菌。優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用簡單、沒有一儀器上的限制缺點(diǎn)：由于基因組DNA相對很復(fù)雜，很難獲得覆蓋基因組的單鏈DNA片段，導(dǎo)致基因丟失；在基因組DNA與文庫DNA雜交的過程中，文庫DNA自身雜交的速度會很快，導(dǎo)致基因丟失。⑵基因組DNA飽和雜交法原理：雙鏈DNA在加熱變后再復(fù)性形成雙鏈DNA的速度遵循二次復(fù)性動力學(xué)原理。即與組分中的單鏈DNA濃度有關(guān)，濃度越小，復(fù)性所需時(shí)間越長。cDNA文庫中高豐度的cDNA復(fù)性所需要的時(shí)間短，低豐度的cDNA復(fù)性所需的時(shí)間長。通過對復(fù)性時(shí)間的控制，可以使高豐度的cDNA復(fù)性成雙鏈狀態(tài)，低豐度的cDNA保持單鏈狀態(tài)。利用羥基磷灰石柱很容易將單鏈和雙鏈cDNA分開，再用得到的單鏈cDNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌，即可得到均一化cDNA文庫。優(yōu)點(diǎn)：幾乎不會導(dǎo)致文庫中cDNA的丟失；均一化效果明顯缺點(diǎn)：基因組DNA飽和雜交法成功率高，而基因組DNA飽和雜交法在參數(shù)控制上存在著比較多的因素。2、扣除雜交cDNA文庫原理：利用分子雜交原理，去除非差異表達(dá)基因的cDNA，保留差異表達(dá)的基因的cDNA用于制備文庫。待測樣本tester:待測樣本的總cDNA。對照樣本driver:表達(dá)譜背景一致但不含目的基因的總cDNA。tester與過量的driver雜交，用特定方法將二者共同表達(dá)的cDNA去除。如：抑制性扣除雜交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)原理：含目的基因的cDNA稱為供體tester，不含目的基因的cDNA稱為驅(qū)動driver。它們是由對應(yīng)的mDNA組分在體外獨(dú)立反轉(zhuǎn)錄成的。同時(shí)利用識別4個(gè)堿基的限制性內(nèi)切酶RsaΙ將這些cDNA消化成平末端小片段。將供體一分為二，分別接上二種不同的接頭。第一輪雜交：過量的驅(qū)動cDNA分別與帶有2中不同接頭的供體cDNA雜交，在2個(gè)獨(dú)立的雜交體系中，供體與驅(qū)動cDNA會形成4種類型的cDNA片段：a、供體中既沒有與供體雜交，也沒有與驅(qū)動雜交的cDNA分子。b、供體中自身雜交的cDNA分子。c、供體與驅(qū)動中共同表達(dá)的基因雜交形成的雙鏈cDNA分子。d、驅(qū)動中自身雜交和不能自身或與供體雜交的cDNA分子。第二輪雜交：將第一輪雜交的兩個(gè)體系混合，再加入過量的驅(qū)動cDNA，進(jìn)入第二輪雜交。雜交結(jié)果進(jìn)一步形成了a、b、c、d。也形成了e（帶不同接頭a形成的）。將第二輪雜交的產(chǎn)物進(jìn)行末端補(bǔ)齊，再進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中，由于a、d兩端沒有引物結(jié)合位點(diǎn)而不能再擴(kuò)增。b兩端帶有相同的接頭序列，形成蝸柄結(jié)構(gòu)，不能進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。c只有一個(gè)引物接頭，只能被線性擴(kuò)增。只有e是均一化的，差異表達(dá)的基因。用巢式引物進(jìn)行第二輪PCR，降低PCA產(chǎn)物的背景，富集差異的基因。最后將PCR產(chǎn)物用T/A克隆載體進(jìn)行克隆構(gòu)建扣除雜交cDNA文庫3、煙草酸性焦磷酸酶法構(gòu)建全長cDNA文庫原理：煙草酸性焦磷酸酶（TAP），能特異性地識別真核生物mRNA的5’端帽子結(jié)構(gòu)并將其去除。暴露出切口5’①在反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈前對mRNA進(jìn)行去磷酸化處理，使不完整的mRNA分子暴露的5’②在反應(yīng)中加入TAP，特意的去掉完整mRNA分子5’末端的帽子結(jié)構(gòu)，暴露出5③在T4RNA連接酶的作用下，可以在5’4、酵母雙雜交系統(tǒng)（畫圖）P207簡稱雙雜交系統(tǒng)（two-hybriclsystem）也叫相互作用陷阱（interactiontrap）是根據(jù)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)，創(chuàng)建的一種體內(nèi)鑒定基因的方法。其篩選的基因不是“探針”的直接編碼產(chǎn)物，而是能夠與其相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因，即篩選與一直基因產(chǎn)物發(fā)生相互作用的蛋白的編碼基因。許多真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子有兩個(gè)功能區(qū)域，一是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbindingdomain,BD），可與DNA序列的特定位點(diǎn)即上游激活序列結(jié)合；二是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain,AD）,協(xié)助RNA聚合酶‖復(fù)合體激活上游激活序列下游基因的轉(zhuǎn)錄。將X與BD融合，蛋白Y與AD融合，將它們導(dǎo)入酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果X和Y相互作用，則會導(dǎo)致BD和AD在空間上接近，形成一個(gè)有功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。5、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（畫圖）原理：根癌農(nóng)桿菌內(nèi)有一個(gè)大的致瘤質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）,簡稱Ti質(zhì)粒，當(dāng)根癌農(nóng)桿菌感染植物時(shí)，菌體本身并沒有進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，而僅是Ti質(zhì)粒中一部分稱之為“T-DNA”的DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞并插入基因組中，T-DNA中的基因利用植物的酶系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，其表達(dá)產(chǎn)物可誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的基因結(jié)構(gòu)主要分為T-DNA區(qū)（transferredDNAregion）、Vir區(qū)（virulenceregion）、Con區(qū)（regionencodingconjugation）和Ori區(qū)（originofreplication）4個(gè)區(qū)段。T-DNA區(qū)稱為轉(zhuǎn)移DNA區(qū)。即根癌農(nóng)桿菌侵染植物時(shí)轉(zhuǎn)移到植物基因族中的一段DNA序列，該序列上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。Vir區(qū)與T-DNA區(qū)相鄰，該基因可激活T-DNA的專一，使植物致瘤，故稱毒性區(qū)。Con區(qū)段上存在與細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，調(diào)控Ti質(zhì)粒在根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)移，故稱為結(jié)合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。Ori區(qū)主要調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。過程：①農(nóng)桿菌對受體的識別②農(nóng)桿菌附著到受體細(xì)胞③誘導(dǎo)和啟動毒性區(qū)基因表達(dá)④類似結(jié)合孔復(fù)合物的合成和裝配⑤T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)6、一元載體的構(gòu)建的基本原理①將Ti質(zhì)粒上T-DNA中的致瘤基因全部去掉，使其喪失對植物的致瘤性。僅保留其兩側(cè)邊界與T-DNA準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移所必須的25個(gè)堿基序列，故這種載體又稱為卸甲載體。②由于根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒比較大，難以進(jìn)行體外遺傳操作，需要引入一個(gè)較小的中間載體，將欲轉(zhuǎn)化的目的基因構(gòu)建于中間載體上。③在卸甲載體T-DNA區(qū)中刪除致癌基因的位點(diǎn)插入一段與中間載體同源的質(zhì)粒序列。④將中間載體轉(zhuǎn)移到含有卸甲載體的根癌農(nóng)桿菌中。由于卸甲載體的T-DNA與中間載體具有同源序列，故可在根癌農(nóng)桿菌中發(fā)生同源重組。將中間載體整合到卸甲載體的T-DNA區(qū)，并與卸甲質(zhì)粒一起復(fù)制。⑤為發(fā)生整合的中間載體因其沒有在根瘤農(nóng)桿菌中的復(fù)制元件，會自行消失。⑥根據(jù)中間載體上所攜帶的抗性基因進(jìn)行抗性篩選，即可。7、二元載體的構(gòu)建的基本原理原理：對于一元載體來說，因?yàn)槠銽-DNA與Vir區(qū)是在同一載體上，故又稱順式載體。而事實(shí)上，T-DNA與Vir區(qū)完全沒有必要一定要構(gòu)建到同一載體。當(dāng)它們處于不同載體上時(shí)，Vir區(qū)通過反式作用依然可以使T-DNA發(fā)生轉(zhuǎn)移。二元載體中，根癌農(nóng)桿菌菌株中含有兩個(gè)Ti質(zhì)粒，一個(gè)稱為微型Ti質(zhì)粒，一個(gè)稱為輔助Ti質(zhì)粒。其中微型Ti質(zhì)粒缺失了Vir區(qū)，其T-DNA也進(jìn)行了卸甲處理，同時(shí)引入多個(gè)酶切位點(diǎn)，方便外源基因的插入，此外，具有廣譜的復(fù)制原件，可同時(shí)在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中生存。經(jīng)過改造的微型Ti質(zhì)粒相當(dāng)小，可像一般質(zhì)粒一樣進(jìn)行遺傳操作。輔助Ti質(zhì)粒相對較大，只去除了T-DNA，可激活微型Ti質(zhì)粒上的T-DNA發(fā)生轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(diǎn)：二元載體構(gòu)建較為方便；由于一元載體的T-DNA中含有中間載體，它們會隨同外源目的基因一起被轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)，而二元載體的不會帶入大量無用的冗長DNA序列。因此外源基因的轉(zhuǎn)化效率高于一元載體。8、Sanger雙脫氧鏈終止法（畫圖）P158雙脫氧鏈終止測序法使用雙脫氧核苷酸，它與脫氧核苷酸的主要不同在于：雙脫氧核苷酸分子中脫氧核糖的3’位置的羥基（—OH）缺失。擴(kuò)增時(shí)，在DNA聚合酶的作用下，其5’位置的磷酸基團(tuán)與上位脫氧核苷酸的3’位置的羥基結(jié)合，但是，由于其自身39、載體的分類按功能分：克隆載體：（主要用于擴(kuò)增或保存DNA片段，是最簡單的載體。具有強(qiáng)大的包裝能力）表達(dá)載體：（帶有目標(biāo)細(xì)胞識別的啟動子）其他載體：（整合載體、穿梭載體等）按來源分：質(zhì)粒（細(xì)菌等原核生物染色體外遺傳物質(zhì)）噬菌體（原核細(xì)胞的病毒）真核病毒（真核細(xì)胞的病毒）