1第十二章熒光分析法fluorometry1第十二章熒光分析法fluorometry2概述某些物質(zhì)受到光照射時(shí)，除吸收某種波長(zhǎng)的光之外還會(huì)發(fā)射出比原來(lái)所吸收的光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光，最常見(jiàn)的光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光。

2概述某些物質(zhì)受到光照射時(shí)，除吸收某種波長(zhǎng)的光之外還會(huì)3熒光的分類根據(jù)物質(zhì)是分子還是原子：分子熒光

原子熒光

根據(jù)照射光的種類：紫外熒光

X射線熒光紅外熒光方法測(cè)定靈敏度

10-1010-12g/ml

3熒光的分類根據(jù)物質(zhì)是分子還是原子：分子熒光方法測(cè)定靈敏4第一節(jié)

基本原理一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1．分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程=hcES0S1*T14第一節(jié)基本原理一、分子熒光=hcES0S15S0V=0123S1*S2*VnT1*熒光與磷光產(chǎn)生示意圖5S0V=0123S1*S2*VnT1*熒光與磷光產(chǎn)生示意62.熒光和磷光產(chǎn)生振動(dòng)弛豫vibrationalrelexation內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換internalconversion熒光發(fā)射fluorometry外部能量轉(zhuǎn)換externalconversion體系間跨越intersystemcrossing磷光的產(chǎn)生62.熒光和磷光產(chǎn)生振動(dòng)弛豫vibrationalr7（二）激發(fā)光譜與發(fā)射光譜光源單色器1單色器2檢測(cè)器excitationspectrum

橫坐標(biāo)ex，縱坐標(biāo)發(fā)射光強(qiáng)度f(wàn)luorescencespectrum

橫坐標(biāo)em，縱坐標(biāo)發(fā)射光強(qiáng)度7（二）激發(fā)光譜與發(fā)射光譜光源單色器1單色器2檢測(cè)器ex8溶液熒光光譜通常具有如下特征Stokesshift熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系

8溶液熒光光譜通常具有如下特征Stokesshift9斯托克斯位移’=-’9斯托克斯位移’=-’10熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)不管分子激發(fā)到s1還是s2，熒光的發(fā)生總是從s1開(kāi)始，熒光光譜的形狀是一樣的。熒光強(qiáng)度(nm)40030050010熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)不管分子激發(fā)到s1還是s2，11熒光強(qiáng)度nm250350V=01234S0S1*12340蒽的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)11熒光強(qiáng)度nm250350V=01234S0S1*123412除去激發(fā)光源后，熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e的時(shí)間二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率

fluorescencelifttime，fFt=F0e-Kt

當(dāng)t=f

時(shí)，F(xiàn)t=（1/e）F0

（1/e）F0=F0e-Kf

即（1/e）=e-KfKf=1K=1/f∴Ft=F0e-t/

f12除去激發(fā)光源后，熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e的時(shí)間13求熒光壽命Ft=F0e-t/flnF0Fttf=lnF0Ftt直線斜率為1f13求熒光壽命Ft=F0e-t/flnF0F14fluorescenceefficiency

(fluorescencequantumyield)f=發(fā)射熒光的光子數(shù)吸收激發(fā)光的光子數(shù)14fluorescenceefficiency

(flu15（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)分子的剛性取代基15（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)161.長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)對(duì)于芳香族化合物，共軛越長(zhǎng)，ex和em都長(zhǎng)移，熒光效率也提高。ex=205nmem=278nmex=286nmem=321nmex=356nmem=404nmf=0.11f=0.36f=0.29長(zhǎng)共軛的脂肪烴也有熒光161.長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)對(duì)于芳香族化合物，共軛越長(zhǎng)，ex和172.分子的剛性同樣具有*躍遷的長(zhǎng)共軛分子中，剛性和共平面性越大，越大，長(zhǎng)移。CH2f=0.2f=1.0172.分子的剛性同樣具有*躍遷的長(zhǎng)共軛分子中，剛性18剛性和共平面性增加電子的共軛程度增加-COO-COO-COO-O熒光素鈉酚酞18剛性和共平面性增加電子的共軛程度增加-COO-C19原來(lái)不發(fā)生熒光的，如：8-羥基喹啉N-OHN-OMg1/2Mg原來(lái)共平面性較好的-NCH3CH3SO3NaNCH3CH3SO3Na1-二甲氨基萘-7-磺酸鹽1-二甲氨基萘-8-磺酸鹽

19原來(lái)不發(fā)生熒光的，如：8-羥基喹啉N-OHN-OMg1/20取代基的影響供電子基團(tuán)-NH2、-OH、-OCH3吸電子基團(tuán)-COOH、-NO2、

-NHCOCH3-R、-SO3H、-NH3+使使影響較小20取代基的影響供電子基團(tuán)-NH2、-OH、-OCH3使21（三）熒光試劑熒光胺Dansyl-Cl鄰苯二甲醛(OPA)測(cè)定無(wú)機(jī)離子的熒光試劑21（三）熒光試劑熒光胺22熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺反應(yīng)COOHONROH-NH2R-NH2ex275,490nmem480nmOOOO22熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺反應(yīng)COOHONROH-NH23Dansyl-Cl與伯仲胺及酚羥基反應(yīng)NCH3CH3SO2ClNCH3CH3SO2NHR+RNH2無(wú)水丙酮+HClex365nmem~500nm23Dansyl-Cl與伯仲胺及酚羥基反應(yīng)NCH3CH3S24鄰苯二甲醛(OPA)與伯胺反應(yīng)-CHO-CHO+RNH2+HSCH2CH2OHN-RSCH2CH2OH+2H2OpH9~10OH-ex340nmem~455nm24鄰苯二甲醛(OPA)與伯胺反應(yīng)-CHO-CHO+RNH25無(wú)機(jī)離子一般本身沒(méi)有熒光，但與一些有機(jī)試劑生成配合物后，可產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光N-OHN-OLi+Li+ex370nmem580nmP235表12-125無(wú)機(jī)離子一般本身沒(méi)有熒光，但與一些有機(jī)試劑生成配合物后，26有些無(wú)機(jī)陰離子可使熒光熄滅N-OHN-OAl1/3+Al+CN-使熒光熄滅或減弱F-26有些無(wú)機(jī)陰離子可使熒光熄滅N-OHN-OAl1/3+27三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素

極性溶劑使K帶吸收長(zhǎng)移，躍遷幾率增大，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，強(qiáng)度增加。溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度減弱。溶劑

溫度溫度升高熒光效率下降27三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素極性溶劑使K帶吸收長(zhǎng)移，28

pH值的影響NH2NH3+NH-pH<2無(wú)熒光pH>13無(wú)熒光pH7~12蘭色熒光OHHO3S-O--O3S-pH<6.4無(wú)熒光pH>6.4蘭色熒光28pH值的影響NH2NH3+NH-pH<2無(wú)熒光pH29

熒光熄滅劑的影響熒光熄滅劑quenchingmedium發(fā)生碰撞而使之失去能量生成不發(fā)光的配位化合物溴、碘以及溶解氧的存在，實(shí)現(xiàn)體系間跨越，轉(zhuǎn)變成三線態(tài)。熒光熄滅法fluordscencequenchingmethod熒光自熄滅C>1g/l29熒光熄滅劑的影響熒光熄滅劑quenchingme30散射光的干擾scatteringlight光子與物質(zhì)分子碰撞彈性碰撞非彈性碰撞碰撞雙方能量不變光子運(yùn)動(dòng)方向改變碰撞過(guò)程中發(fā)生能量傳遞，同時(shí)光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變ReyleighscatteringlightRamanscatteringlight30散射光的干擾scatteringlight光子與物質(zhì)31硫酸奎寧在不同ex的熒光與散射光譜Fnm320448350448360400ex320nmReyleigh320nmRaman360nmem448nmex350nmReyleigh350nmRaman400nmem448nm對(duì)測(cè)定無(wú)影響對(duì)測(cè)定有影響31硫酸奎寧在不同ex的熒光與散射光譜Fnm320448332在不同波長(zhǎng)激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長(zhǎng)32在不同波長(zhǎng)激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長(zhǎng)33I0IF第三節(jié)定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系F=K’(I0-I)I=I010-ECLF=K’I0(1-10-ECL)=K’I0(1-e-2.3ECL)33I0IF第三節(jié)定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)34e-2.3ECL=1+F=K’I0(1-10-ECL)=K’I0(1-e-2.3ECL)(-2.3ECL)11!+(-2.3ECL)22!F=K’I0[1-(1+(-2.3ECL)11!(-2.3ECL)22!++…)](-2.3ECL)33!+=K’I0[2.303ECl-(-2.3ECL)22!(-2.3ECL)33!-…]若C很小，ECl≤0.05則F=2.3K’I0ECl=KC+…34e-2.3ECL=1+F=K’I0(1-10-ECL35F=2.3K’I0ECl=KCECl≤0.05FCECl

>0.05F與C不成正比熒光法紫外法FA=-lgT=-lgI

/I0

熒光分析法的靈敏度高于紫外-可見(jiàn)分光光度法35F=2.3K’I0ECl=KCECl≤0.05F36二、定量分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法比例法多組分分析C1C2C3C4C5100%2060804080%16486432用空白溶液調(diào)零用標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)滿刻度36二、定量分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法C1C237比例法（對(duì)比法）若在某濃度范圍中成線性，可用比例法測(cè)定CsCxFsFx=CxFsFx=CsCsCxFs-F0Fx-F0=CxFs-F0Fx-F0=Cs37比例法（對(duì)比法）若在某濃度范圍中成線性，可用比例法測(cè)定C38多組分分析各組分熒光峰不重疊，可分別測(cè)定相互重疊，可利用熒光強(qiáng)度的加和性，如：ba12Fa

=KaCa

+KbCb1:Fa’

=Ka’

Ca

+Kb’Cb2:38多組分分析各組分熒光峰不重疊，可分別測(cè)定ba12Fa39第四節(jié)儀器與熒光分析新技術(shù)光源單色器樣品池檢測(cè)器單色器放大器顯示器濾光片熒光計(jì)濾光片—單色器熒光分光光度計(jì)39第四節(jié)儀器與熒光分析新技術(shù)光源單色器樣品池檢測(cè)器40儀器的校正靈敏度波長(zhǎng)激發(fā)光譜和熒光光譜40儀器的校正靈敏度41熒光分析新技術(shù)簡(jiǎn)介1.激光熒光分析以激光作光源，譜線更純、強(qiáng)度更大?？商岣哽`敏度和專一性。一次測(cè)量所需樣品液<1g，可測(cè)至10-14~10-16g。新技術(shù)儀器方面更新化學(xué)方法改善41熒光分析新技術(shù)簡(jiǎn)介1.激光熒光分析新技術(shù)儀器方面更新422.時(shí)間分辨熒光

time-resolvedfluorometry樣品雜質(zhì)脈沖激光10-10s10-12s422.時(shí)間分辨熒光

time-resolved433.同步熒光分析

synchronousfluorometry若：=em-exF=K’（ex

）（em

）CFexFemF=K’（ex

）（ex+）Cf=fCF=K’（em-）（em）CK=KC433.同步熒光分析

synchronousfl44熒光黃、羅丹明6G、羅丹明B混合物的同步熒光光譜（=3nm）F熒光黃羅丹明6G羅丹明B44熒光黃、羅丹明6G、羅丹明B混合物的同步熒光光譜（454.膠束增敏熒光CH3(CH2)11OSO3-Na+非極性疏水基團(tuán)極性親水基團(tuán)增加溶解度增加熒光效率增加熒光的穩(wěn)定性454.膠束增敏熒光CH3(CH2)11OSO3-Na+非46第十二章熒光分析法fluorometry1第十二章熒光分析法fluorometry47概述某些物質(zhì)受到光照射時(shí)，除吸收某種波長(zhǎng)的光之外還會(huì)發(fā)射出比原來(lái)所吸收的光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光，最常見(jiàn)的光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光。

2概述某些物質(zhì)受到光照射時(shí)，除吸收某種波長(zhǎng)的光之外還會(huì)48熒光的分類根據(jù)物質(zhì)是分子還是原子：分子熒光

原子熒光

根據(jù)照射光的種類：紫外熒光

X射線熒光紅外熒光方法測(cè)定靈敏度

10-1010-12g/ml

3熒光的分類根據(jù)物質(zhì)是分子還是原子：分子熒光方法測(cè)定靈敏49第一節(jié)

基本原理一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1．分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程=hcES0S1*T14第一節(jié)基本原理一、分子熒光=hcES0S150S0V=0123S1*S2*VnT1*熒光與磷光產(chǎn)生示意圖5S0V=0123S1*S2*VnT1*熒光與磷光產(chǎn)生示意512.熒光和磷光產(chǎn)生振動(dòng)弛豫vibrationalrelexation內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換internalconversion熒光發(fā)射fluorometry外部能量轉(zhuǎn)換externalconversion體系間跨越intersystemcrossing磷光的產(chǎn)生62.熒光和磷光產(chǎn)生振動(dòng)弛豫vibrationalr52（二）激發(fā)光譜與發(fā)射光譜光源單色器1單色器2檢測(cè)器excitationspectrum

橫坐標(biāo)ex，縱坐標(biāo)發(fā)射光強(qiáng)度f(wàn)luorescencespectrum

橫坐標(biāo)em，縱坐標(biāo)發(fā)射光強(qiáng)度7（二）激發(fā)光譜與發(fā)射光譜光源單色器1單色器2檢測(cè)器ex53溶液熒光光譜通常具有如下特征Stokesshift熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系

8溶液熒光光譜通常具有如下特征Stokesshift54斯托克斯位移’=-’9斯托克斯位移’=-’55熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)不管分子激發(fā)到s1還是s2，熒光的發(fā)生總是從s1開(kāi)始，熒光光譜的形狀是一樣的。熒光強(qiáng)度(nm)40030050010熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)不管分子激發(fā)到s1還是s2，56熒光強(qiáng)度nm250350V=01234S0S1*12340蒽的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)11熒光強(qiáng)度nm250350V=01234S0S1*123457除去激發(fā)光源后，熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e的時(shí)間二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率

fluorescencelifttime，fFt=F0e-Kt

當(dāng)t=f

時(shí)，F(xiàn)t=（1/e）F0

（1/e）F0=F0e-Kf

即（1/e）=e-KfKf=1K=1/f∴Ft=F0e-t/

f12除去激發(fā)光源后，熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e的時(shí)間58求熒光壽命Ft=F0e-t/flnF0Fttf=lnF0Ftt直線斜率為1f13求熒光壽命Ft=F0e-t/flnF0F59fluorescenceefficiency

(fluorescencequantumyield)f=發(fā)射熒光的光子數(shù)吸收激發(fā)光的光子數(shù)14fluorescenceefficiency

(flu60（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)分子的剛性取代基15（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)611.長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)對(duì)于芳香族化合物，共軛越長(zhǎng)，ex和em都長(zhǎng)移，熒光效率也提高。ex=205nmem=278nmex=286nmem=321nmex=356nmem=404nmf=0.11f=0.36f=0.29長(zhǎng)共軛的脂肪烴也有熒光161.長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)對(duì)于芳香族化合物，共軛越長(zhǎng)，ex和622.分子的剛性同樣具有*躍遷的長(zhǎng)共軛分子中，剛性和共平面性越大，越大，長(zhǎng)移。CH2f=0.2f=1.0172.分子的剛性同樣具有*躍遷的長(zhǎng)共軛分子中，剛性63剛性和共平面性增加電子的共軛程度增加-COO-COO-COO-O熒光素鈉酚酞18剛性和共平面性增加電子的共軛程度增加-COO-C64原來(lái)不發(fā)生熒光的，如：8-羥基喹啉N-OHN-OMg1/2Mg原來(lái)共平面性較好的-NCH3CH3SO3NaNCH3CH3SO3Na1-二甲氨基萘-7-磺酸鹽1-二甲氨基萘-8-磺酸鹽

19原來(lái)不發(fā)生熒光的，如：8-羥基喹啉N-OHN-OMg1/65取代基的影響供電子基團(tuán)-NH2、-OH、-OCH3吸電子基團(tuán)-COOH、-NO2、

-NHCOCH3-R、-SO3H、-NH3+使使影響較小20取代基的影響供電子基團(tuán)-NH2、-OH、-OCH3使66（三）熒光試劑熒光胺Dansyl-Cl鄰苯二甲醛(OPA)測(cè)定無(wú)機(jī)離子的熒光試劑21（三）熒光試劑熒光胺67熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺反應(yīng)COOHONROH-NH2R-NH2ex275,490nmem480nmOOOO22熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺反應(yīng)COOHONROH-NH68Dansyl-Cl與伯仲胺及酚羥基反應(yīng)NCH3CH3SO2ClNCH3CH3SO2NHR+RNH2無(wú)水丙酮+HClex365nmem~500nm23Dansyl-Cl與伯仲胺及酚羥基反應(yīng)NCH3CH3S69鄰苯二甲醛(OPA)與伯胺反應(yīng)-CHO-CHO+RNH2+HSCH2CH2OHN-RSCH2CH2OH+2H2OpH9~10OH-ex340nmem~455nm24鄰苯二甲醛(OPA)與伯胺反應(yīng)-CHO-CHO+RNH70無(wú)機(jī)離子一般本身沒(méi)有熒光，但與一些有機(jī)試劑生成配合物后，可產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光N-OHN-OLi+Li+ex370nmem580nmP235表12-125無(wú)機(jī)離子一般本身沒(méi)有熒光，但與一些有機(jī)試劑生成配合物后，71有些無(wú)機(jī)陰離子可使熒光熄滅N-OHN-OAl1/3+Al+CN-使熒光熄滅或減弱F-26有些無(wú)機(jī)陰離子可使熒光熄滅N-OHN-OAl1/3+72三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素

極性溶劑使K帶吸收長(zhǎng)移，躍遷幾率增大，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，強(qiáng)度增加。溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度減弱。溶劑

溫度溫度升高熒光效率下降27三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素極性溶劑使K帶吸收長(zhǎng)移，73

pH值的影響NH2NH3+NH-pH<2無(wú)熒光pH>13無(wú)熒光pH7~12蘭色熒光OHHO3S-O--O3S-pH<6.4無(wú)熒光pH>6.4蘭色熒光28pH值的影響NH2NH3+NH-pH<2無(wú)熒光pH74

熒光熄滅劑的影響熒光熄滅劑quenchingmedium發(fā)生碰撞而使之失去能量生成不發(fā)光的配位化合物溴、碘以及溶解氧的存在，實(shí)現(xiàn)體系間跨越，轉(zhuǎn)變成三線態(tài)。熒光熄滅法fluordscencequenchingmethod熒光自熄滅C>1g/l29熒光熄滅劑的影響熒光熄滅劑quenchingme75散射光的干擾scatteringlight光子與物質(zhì)分子碰撞彈性碰撞非彈性碰撞碰撞雙方能量不變光子運(yùn)動(dòng)方向改變碰撞過(guò)程中發(fā)生能量傳遞，同時(shí)光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變ReyleighscatteringlightRamanscatteringlight30散射光的干擾scatteringlight光子與物質(zhì)76硫酸奎寧在不同ex的熒光與散射光譜Fnm320448350448360400ex320nmReyleigh320nmRaman360nmem448nmex350nmReyleigh350nmRaman400nmem448nm對(duì)測(cè)定無(wú)影響對(duì)測(cè)定有影響31硫酸奎寧在不同ex的熒光與散射光譜Fnm320448377在不同波長(zhǎng)激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長(zhǎng)32在不同波長(zhǎng)激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長(zhǎng)78I0IF第三節(jié)定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系F=K’(I0-I)I=I010-ECLF=K’I0(1-10-ECL)=K’I0(1-e-2.3ECL)33I0IF第三節(jié)定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)79e-2.3ECL=1+F=K’I0(1-10-ECL)=K’I0(1-e-2.3ECL)(-2.3ECL)11!+(-2.3ECL)22!F=K’I0[1-(1+(-2.3ECL)11!(-2.3ECL)22!++…)](-2.3ECL)33!+=K’I0[2.303ECl-(-2.3ECL)22!(-2.3ECL)33!-…]若C很小，ECl≤0.05則F=2.3K’I0ECl=KC+…34e-2.3ECL=1+F=K’I0(1-10-ECL80F=2.3K’I0ECl=KCECl≤0.05FCECl

>0.05F與C不成正比熒光法紫外法FA=-lgT=-lgI

/I0

熒光分析法的靈敏度高于紫外-可見(jiàn)分光光度法35F=2.3K’I0ECl=KCECl≤0.05F81二、定量分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法比例法多組分分析C1C2C3