17/17利用殼聚糖涂層的自身免疫活性促進(jìn)帶孔聚己內(nèi)酯支架中血管、骨和軟骨的生成

聚(ε-己內(nèi)酯)(PCL)作為性能良好的聚合物受到了廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)非炎性殼聚糖涂層促進(jìn)軟骨浸潤(rùn)到PCL支架內(nèi)及其上方，并且與骨小梁整合兼容。體外成骨試驗(yàn)預(yù)測(cè)骨整合到多孔支架中的能力有限，因?yàn)樵隗w內(nèi)，編織骨從再生骨小梁的前緣整合，而不是從粘附在支架表面的間充質(zhì)細(xì)胞整合，并且生物活性涂層吸引炎癥細(xì)胞而誘導(dǎo)骨吸收。

01、研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介

骨組織工程（BTE）策略旨在控制聚合物結(jié)構(gòu)和生物活性，以促進(jìn)骨生長(zhǎng)成多孔支架。盡管在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)方面取得了很大進(jìn)展，但在理解如何引導(dǎo)骨髓細(xì)胞和血管向內(nèi)遷移和分化，以在多孔支架深處形成礦化組織方面仍然存在挑戰(zhàn)。PCL作為首選的生物相容性聚合物受到了廣泛關(guān)注，部分原因是生物塑料可以熔化形成不同的形狀，支持間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在體外的細(xì)胞浸潤(rùn)和成骨，并允許體內(nèi)編織骨沉積（在外源細(xì)胞或生物活性因子的幫助下）。孔徑是影響體內(nèi)骨整合到不同材料中的一個(gè)重要因素。孔徑≤100μm的支架顯示出有限的血管化，同時(shí)促進(jìn)軟骨形成。血管化的骨會(huì)自發(fā)地滲入具有>100μm-850μm孔的支架中，但通常僅限于外孔。

此前的研究開(kāi)發(fā)了具有完全互連孔和精確孔徑的PCL支架，以評(píng)估其潛力在BTE應(yīng)用中。PCL具有抑制細(xì)胞附著的疏水表面，這是體外成骨所必需的。因此，制定了一種用親水性陽(yáng)離子材料涂覆PCL支架孔表面的方法。這是通過(guò)聚電解質(zhì)（PDADMAC作為聚陽(yáng)離子和PSS作為聚陰離子）的逐層自組裝實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)PCL支架涂有99%脫乙酰度(DDA)殼聚糖時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)滲入PCL孔，在3D體外成骨試驗(yàn)中產(chǎn)生更多礦化基質(zhì)?；谶@些有希望的結(jié)果，本研究的目的是使用已建立的骨骼成熟的兔骨軟骨修復(fù)模型，評(píng)估99%DDA殼聚糖涂層對(duì)PCL支架體內(nèi)成骨的影響。

在這項(xiàng)研究中，作者認(rèn)為血腫是植入后第一個(gè)占據(jù)BTE支架的組織。最近的數(shù)據(jù)表明，結(jié)構(gòu)不同的殼聚糖具有不同的先天免疫激活潛力，可用于指導(dǎo)骨折修復(fù)反應(yīng)。99%DDA殼聚糖微粒在體外可在人巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)，包括釋放干擾素α和白細(xì)胞介素1受體拮抗劑。因此，作者使用99%DDA10kDa殼聚糖來(lái)涂覆PCL支架，因?yàn)樗哂屑?xì)胞粘附性、非炎癥性和體內(nèi)潛在的抗炎活性。相比之下，約80%DDA殼聚糖微粒（但不大于95%DDA）在摻入血腫時(shí)會(huì)特異性吸引中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞并刺激血管生成。因此作者通過(guò)將不同的PCL支架壓入骨骺微鉆缺損中以驗(yàn)證以下假設(shè)：當(dāng)涂有99%DDA殼聚糖時(shí)，具有完全連通孔的PCL支架在體內(nèi)骨整合更多，而當(dāng)涂有99%DDA殼聚糖+83%DDA殼聚糖微粒時(shí)，血管生成和成骨更多。僅鉆孔缺陷作為自發(fā)修復(fù)的對(duì)照并在手術(shù)后6周分析了每種情況下6個(gè)骨軟骨缺損的初始缺損和修復(fù)組織。

多孔PCL和殼聚糖涂層的制備：淬火后的45vol%PCL/55vol%PEO混合物分別退火1.5、2.0和2.5小時(shí)制造具有完全互連孔的PCL支架圓柱體，其中2小時(shí)退火周期獲得的155μm±8μm孔徑符合目標(biāo)（圖1a和b）。直徑3毫米，厚2毫米的PCL圓柱體用交替的聚電解質(zhì)逐層處理，然后用99%DDA殼聚糖與結(jié)構(gòu)匹配的殼聚糖熒光示蹤劑相結(jié)合(99PCL)。所有99-PCL支架表面均涂有99%DDA殼聚糖（約1-3μm厚的涂層，圖1c）。將不含熒光示蹤劑99-PCL支架浸泡在含有83%DDARITC-殼聚糖示蹤劑（83-99-PCL）的稀釋83%DDA殼聚糖中，在99PCL支架表面上獲得了均勻的83%DDA殼聚糖表面涂層（圖1d）?？扇苄?3%DDA殼聚糖留在83-99-PCL孔隙空間中，以生產(chǎn)殼聚糖微粒。

Fig.1.FabricationofporousPCLandchitosancoatings.(a)Scaffoldblendsof45%PCL/55%PEOannealedfor1.5,2or2.5hyieldedaverageporesizesof95±4μm,155±8μmand182±10μm,respectively.(b)SEMimageat75×magnificationofaPCLscaffoldwithaverage155μmporediameter.Epifluorescentimagesof(c)99-PCL(withRITC-99%DDAchitosantracer)and(d)8399-PCL(coatedwithunlabeled99%DDAchitosanandthen83%DDAchitosancontainingRITC83%DDAchitosantracer).

“不對(duì)稱”凝塊趨化性測(cè)定：

分析先天免疫細(xì)胞-支架相互作用（圖2）。在37°C的1小時(shí)內(nèi)，外周血凝塊細(xì)胞“蜂擁”到83-99-PCL支架上，與99PCL和PCL相比，支架周邊的細(xì)胞密度高出2倍（p<0.05，圖2a-c)，83-99-PCL凝塊收縮卻與另外3組凝塊收縮相似（圖2d）。如圖2e和2f所示，凝塊細(xì)胞可以吞噬部分99%DDA殼聚糖涂層。至于83%DDA殼聚糖微粒，接近支架時(shí)越來(lái)越多地被吞噬細(xì)胞清除，最強(qiáng)烈的紅色熒光細(xì)胞占據(jù)孔隙并沿著83-99-PCL支架周邊聚集（圖2g），即在體外血腫中對(duì)83-99-PCL有選擇性促炎趨化反應(yīng)。

Fig.2.Invitrobloodclot-scaffoldinteractionsafter1hofinvitrocultureat37?C.Rabbitbloodclot/scaffoldcryosections(a)unstainedor(b)SafraninO/Fastgreenstained,(c)clotcelldensity(n=6)and(d)%clotretraction(n=3).EpifluorescentimagesofclotsamplesshowingRITC-chitosan(red)andHoechst33258-stainedcellnuclei(greyscale),for(e)PCL/clot,(f)99-PCL/clotand(g)83-99-PCL/clotwithchitosanmicroparticles(arrowheads,g1inset),clotcells(arrows,openarrowheads),andcellclustersattheedge(g2,inset).Symbols:opentriangles:clotcellsinsidethepores,whitearrows:clotcellsnearthescaffoldedge,whitearrowheads:83%DDAchitosanmicroparticles.Scalebars:(a,b)1mm,(c,d)200μm,(e,f,g)100μm.

宏觀表現(xiàn)：

在將支架植入出血滑車微鉆孔后，軟骨下血液以與缺陷出血強(qiáng)度（輕、中、重）平行的不同速率滲入PCL孔，與殼聚糖涂層無(wú)關(guān)（圖3）。在術(shù)后第1天，與支架相比，骨軟骨缺損術(shù)中出血、血腫形成和術(shù)后短暫的膝關(guān)節(jié)積液對(duì)6周修復(fù)組織的宏觀外觀影響較小(圖3a-d)。修復(fù)6周后，對(duì)照組被白色修復(fù)組織覆蓋，該組織也覆蓋了大部分99-PCL支架。許多單純PCL和83-99-PCL植入物具有暴露的支架（空心箭頭，圖3f-h）。83-99-PCL修復(fù)組織呈紅色，提示血管生成（粗黑箭頭，圖3h）。股骨遠(yuǎn)端外緣偶爾可見(jiàn)骨贅。所有膝關(guān)節(jié)滑液清澈，無(wú)積液跡象，外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)正常。愈合6周后，兔子活動(dòng)正常，膝蓋沒(méi)有感染跡象。

Fig.3.Osteochondraldefectintra-operativebleeding,hematomaformationandtransientpost-operativekneeeffusionhadminoreffectscomparedtoscaffoldonmacroscopicappearanceof6weekrepairtissues.Panelsshowvariablebleedingindrillholes(a-b)beforeandafterimplantingthescaffolds,(c)hematomaformationatday1,and(d)cumulativepost-operativekneeeffusionscoresandrepresentativemacroscopicappearanceofrepairtissuesfor(e)83-99-PCL,(d)99-PCL,(g)PCL,(h)drill-only.Symbols(e-h)Thickblackarrow:angiogenictissue;openarrows:exposedPCLbioplastic,thinarrows:cartilagerepairtissue.

組織學(xué)及影像學(xué)表現(xiàn)：植入體內(nèi)一天后，PCL支架孔表面檢測(cè)到殼聚糖涂層，而83%DDA殼聚糖微粒被置換到孔中支架凝塊的頂部，這表明來(lái)自關(guān)節(jié)腔方向的軟骨下出血的壓力將顆粒向上推到骨板區(qū)域（圖4紅色信號(hào)）。在83-99PCL、99-PCL和PCL支架下方鉆孔的彎曲底部形成血腫（圖4c，f，圖5）。在該區(qū)域，細(xì)胞在83-99-PCL下方被耗盡，只在支架邊緣發(fā)現(xiàn)（圖4c黑色箭頭）。骨折血腫細(xì)胞更均勻地分布在99-PCL、PCL和單純鉆孔缺陷的下方（圖4f）。在83-99-PCL和99-PCL支架內(nèi)和周圍觀察到含有熒光RITC-殼聚糖的吞噬細(xì)胞（圖4a，d白色箭頭）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了這樣的假設(shè)，即83-99-PCL支架對(duì)血腫吞噬細(xì)胞具有趨化性，并且吞噬細(xì)胞可以攝取兩種殼聚糖涂層。

Fig.4.Hematomaphagocytesswarmedto(a-c)83-99-PCLandnot(d-f)99-PCLscaffoldsafter1dayinvivo.Theredsignalshows(a)83%DDAor(d)99%DDAchitosanand(b,e)matchingnonspecificgreenepifluorescenceofthehematomaofthesamefield.Panels(c&f)showToluidineblue/vonKossastainedhematomabelowthescaffolds(PCLpolymerisindicatedby(*)wherehematomacells(bluestain)weredisplacedtowards(c)83-99PCLandnot(f)99-PCL.Symbols:(a,b,d,e)openarrows:chitosancoating;*=PCLpolymer;openarrowheads:detachedchitosancoating;thinwhitearrows:phagocyteswithinternalizedRITCchitosan;(c,f)blackarrows:hematomacells.Scalebars:250μm.

術(shù)后6周，純鉆頭缺損顯示出持續(xù)的經(jīng)典自發(fā)性軟骨內(nèi)修復(fù)反應(yīng)，其中鈣化軟骨的核心正經(jīng)歷著來(lái)自周圍骨小梁的強(qiáng)烈的血管性骨入侵（圖5，6a-b）。當(dāng)分析平均橫截面積時(shí)，單純?nèi)睋p在缺損邊緣和中部附近時(shí)軟骨下鈣化軟骨較多（圖7a）。發(fā)現(xiàn)主要是軟骨組織從骨板的孔隙中浸潤(rùn)出來(lái)，并不同程度地覆蓋在PCL和99-PCL支架上（圖5和6）。這些修復(fù)組織的形態(tài)表明，軟骨是由緊鄰骨小孔的間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)形成的。與PCL相比，軟骨下軟骨平均滲入99-PCL孔隙更遠(yuǎn)（圖5和6c-d&7a）。83-99PCL支架孔隙以及支架中間明顯沒(méi)有軟骨，邊緣有0.2mm2的軟骨下軟骨（圖5和6f-g&7a）。

觀察到83-99-PCL有強(qiáng)烈的血管生成反應(yīng)，血管圍繞著整個(gè)支架的孔隙并完全浸潤(rùn)其中（圖5o、5和6g紅色組織）。單純?nèi)睋p和83-99-PCL缺損的血管長(zhǎng)度密度（Lv）相似（圖7b），然而單純?nèi)睋p的血管被礦化組織包裹（圖6b），而83-99-PCL的血管則被非礦化纖維組織或未分化的間質(zhì)包裹（圖6g1，g2）。與PCL或99-PCL相比，單純?nèi)睋p修復(fù)組織和83-99-PCL孔隙組織所含的血管Lv明顯升高（圖7b）。綜上所述，親炎癥的83%DDA殼聚糖刺激了整個(gè)PCL支架孔的血管生成，并抑制了軟骨生成和成骨。

SafraninO（SafO）染色的軟骨修復(fù)組織重現(xiàn)缺陷與作為解釋變量的軟骨下面積呈正相關(guān)（R2=0.44，P<0.0001）。在這項(xiàng)研究中，單純?nèi)睋p在修復(fù)6周后顯示出良好的SafO染色的軟骨再生（圖5、6a和7c）。覆蓋支架的軟骨修復(fù)組織較少，83-99-PCL上的軟骨最少，PCL中間的軟骨較少（圖7c）。99%DDA殼聚糖的主要影響是，在支架中間上方的SafO+軟骨復(fù)位與單獨(dú)的PCL相比，保持3倍以上的SafO+軟骨復(fù)位（圖7c）。這種效果部分是由于純PCL支架中間的軟組織重鋪不理想（圖7d）。

根據(jù)對(duì)鉆孔中礦化組織再生的顯微CT測(cè)量（圖8），初始缺損的骨量分?jǐn)?shù)在單純?nèi)睋p修復(fù)6周后顯著增加，用PCL或99-PCL的缺損略高，而83-99-PCL則較低（圖8f）。最初的缺損鉆孔橫截面積為7.5mm2，在單純?nèi)睋p中，頂部縮小到3.5mm2，在0.5mm深的骨小梁處縮小到1mm2（圖8g）。在6周修復(fù)的PCL和99-PCL缺損中，殘留的鉆孔面積略微縮小至6.5mm2，與第1天的缺損沒(méi)有明顯區(qū)別。相比之下，83-99-PCL缺損的鉆孔橫截面積凈增1毫米（圖8g）。在6個(gè)支架中的4個(gè)中，編織的骨質(zhì)滲入99-PCL和PCL孔隙深處0.3-1毫米。在所有的支架孔隙表面（99-PCL、PCL和83-99-PCL）都檢測(cè)到骨髓來(lái)源的細(xì)胞附著。因此，殼聚糖涂層對(duì)于細(xì)胞在體內(nèi)粘附到疏水性PCL孔隙表面是不必要的。

Fig.5.NondecalcifiedhistologyatthedefectedgeormiddleshowingahematomafillingPCLporesatDay1andbonemarrowderivedrepairtissuesfillingtheporesat6weekspost-operative.Panelsshow(a-d)Drill-only,(e-h)PCL,(i-l)99-PCL,(m-p)8399-PCLnon-decalcifiedplasticsections,stainedwithSafO-fastgreen(Edge:a1,c1,e1,g1,i1,k1,m1),vonKossa/Toluidineblue(edgeandmiddle:b,d,f,h,j,l,n,p)orGoldnerTrichrome(Edge:o1;Middle:a2,c2,e2,g2,i2,k2,m2,o2).SafOstainscartilagetissuered,GoldnerTrichromestainsbonegreenandnewlydepositedbone,bloodvesselsandcartilagepink/red,vonKossa/Toluidinebluestainsmineralizedcartilageandboneblack,cartilagetissuepurple.Scalebar:1mm.

Fig.6.High-magnificationhistologyofrepresentative6weeksubchondralrepairtissuesstainedwithToluidineblue-vonKossa(a,c,d,e,g2)orGoldnertrichrome(b,f,g1).Drill-onlydefects(a-b)wereundergoingendochondralossificationwhereboneandbloodvesselsinvadecalcifyingcartilage.Scaffoldporetissues,hereshownfor99-PCL,included(c)cartilage,(d)calcifyingcartilage(CC),and(e-f)vascularnewwovenbone(NWB)orunmineralizedangiogenictissue.Angiogenicbloodvesselsin83–99-PCLwereoftenenvelopedinfibroustissue(F,inpanelsg1-g2).Symbols:Arrows:bloodvessels.CC:calcifiedcartilage;NWB:newwovenbone.F:fibroustissue.Scalebars:(a,f,g1,g2)250μm,(b,c,d,e)50μm.

Fig.7.Histomorphometryofsubchondral(a1-a2)cartilageinfiltration,(b1-b2)bloodvesselstereologyofangiogenesis(vessels/mm2),and%defectresurfacingwith(c1-c2)SafraninO+cartilageor(d1-d2)allsoftrepairtissuefromtransversesectionsnearthedefectedge(a1-d1)andmiddle(a2-d2).Graphsshowindividualdatapoints(dots),median(horizontalline),interquartilerange(box)andmin-max(whiskers),N=6.

Fig.8.Examplemicro-CTimagesofmineralizedtissueformationinmicrodrilldefectsatday1(a)and6weeks(b-e,conditionsasindicated),(f)measuresofbonevolumefraction(%)ina3mmdiameter2mmdeepvolumeofinterest,and(g)residualdrillholearea(mm2)atthedrillholetopand?0.5mmbelowthechondralosseousjunction(labeledas0,-0.5mm,panelg).Graphsshowindividualdatapoints(dots),median(horizontalline),interquartilerange(box)andmin-max(whiskers),N=6.Scalebar:1mm.

本研究受到少量生物復(fù)制、鉆孔中植入物位置相對(duì)于軟骨-骨連接處的微小差異以及6周終點(diǎn)持續(xù)修復(fù)的限制。關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)支架表面重修具有可變且不受控制的影響，并且在解剖學(xué)上彎曲成滑車槽形狀的支架形狀可能改善了支架上的軟骨修復(fù)（圖9）。

Fig.9.Diminishedresurfacingoversomeproximaldefectswaspotentiallyduethecurvatureofthetrochleaa