1第四節(jié)基因定位常用的方法Wilson于1911年將紅綠色盲基因首次定位于X染色體上,開創(chuàng)了人類基因定位的先河.1968年,Donahue利用系譜分析的方法將Duffy血型基因定位于1號染色體上,是人類首次在常染色體上進行的基因定位.20世紀(jì)70年代后,體細胞雜交重組DNA、分子雜交和PCR等技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，基因定位的方法愈加先進，基因定位的速度、數(shù)量明顯加快。人類基因組計劃的實施和完成，更加促進了基因定位的進程?；蚨ㄎ粚μ岣呷祟悓膊‘a(chǎn)生的病因?qū)W的認識有重要意義。1第四節(jié)基因定位常用的方法Wilson于1911年2

明確幾個基本概念基因：DNA的功能片段?；蚪M：有機體全部DNA序列（它包括基因外的非基因DNA序列），它是基因和非基因DNA序列的總和?；蚨ㄎ唬菏怯靡欢ǖ姆椒▽⒒虼_定到染色體的實際位置。2明確幾個基本概念基3遺傳做圖：是以研究家族的減數(shù)分裂，以了解兩個基因分離趨勢為基礎(chǔ)來繪制基因座位間的距離，它表明基因之間連鎖關(guān)系和相對距離，并以重組率來計算和表示，以厘摩（cM）為單位。染色體定位：只把基因定位到某條染色體上。細胞水平上的基因圖又稱細胞遺傳圖區(qū)域定位：從細胞遺傳學(xué)水平，用染色體顯帶等技術(shù)在光學(xué)顯微鏡下觀察，將基因定位到染色體的具體區(qū)帶。3遺傳做圖：是以研究家族的減數(shù)分裂，以了解兩個基因分離趨勢為4一、基因定位的方法1、體細胞雜交法基因定位：體細胞：即生物體除生殖細胞外的任一細胞。1）體細胞雜交的概念：也稱細胞融合（cellinfusion），是將來源不同的兩種細胞融合成一個新細胞。新產(chǎn)生的細胞稱雜種細胞（hybridcell），含雙親不同的染色體。4一、基因定位的方法1、體細胞雜交法基因定位：5

2）對象：人的細胞鼠類：大鼠、小鼠、倉鼠

3）雜種細胞的特點：在繁殖傳代過程中，人的染色體優(yōu)先丟失，以至最后只剩幾條或一條人的染色體，而嚙齒類的染色體被保留下來。52）對象：人的細胞64）原理：細胞進行融合時，培養(yǎng)液中只有部分細胞融合成雜種細胞，還有大量未融合的雙親細胞。這就需要選擇分離純化雜種細胞。為此要創(chuàng)造一種只讓雜種細胞生長繁殖而親本細胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細胞和親本細胞對生長條件的要求和代謝的差異來進行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。64）原理：7HAT選擇系統(tǒng)：

人的突變細胞株：缺乏HGPRT酶小鼠細胞株：缺乏TK酶兩者融合培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中

HAT培養(yǎng)基：

H為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）

A可阻斷正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）

T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料7HAT選擇系統(tǒng)：人的突變細胞株：缺乏HG8因此在HAT培養(yǎng)基上

人細胞：①由于A的存在，正常的DNA合成通路受阻。②同時由于HGPRT的缺乏，無法利用次黃嘌呤通過旁路合成DNA（嘌呤合成障礙）

8因此在HAT培養(yǎng)基上人細胞：9鼠細胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黃嘌呤合成腺嘌呤，鳥嘌呤，但由于無TK，無法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障礙）

雜種細胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鳥嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）

9鼠細胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT10

將篩選出來的雜種細胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫學(xué)特性，Miller等運用體細胞雜交并結(jié)合雜種細胞的特征，證明雜種細胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17號染色體的雜種細胞都因有TK活性而存活，反之則死亡，從而推斷TK基因定位于17號染色體上，這是首例應(yīng)用體細胞雜交法進行的基因定位。10將篩選出來的雜種細胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培11鼠人XTK-HPRT+TK+HPRT-鼠人鼠人鼠人TK+HPRT+173173173TK+TK+TK-HAT11鼠人XTK-TK+鼠人鼠人鼠人TK+1731731712②克隆嵌板法(clonepanelmethod)

根據(jù)不同雜種細胞保留或丟失的人染色體有時是重疊的情況,設(shè)計的一種簡便而實用的基因定位方法。

克隆嵌板

雜種克隆保留的人染色體

12345678A++++----B++--++--C+-+-+-+-12②克隆嵌板法(clonepanelmethod)132.原位雜交和熒光原位雜交

1）原位雜交（insituhybridization）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物學(xué)技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，胰島素基因用此方法定位于11p15。

2）原理：堿基的互補配對，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA雙鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA或與mRNA互補的cDNA作探針，可檢測細胞基因組中的同源部分。132.原位雜交和熒光原位雜交143）原位雜交的特點：雜交在載玻片上的中期染色體上進行，而不是在溶液和膜上進行。所謂原位是指在標(biāo)本上DNA原位變性，再與放射性或非放射性物質(zhì)（通常用3H）標(biāo)記的已知核酸探針雜交，通過放射自顯影來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強度來確定探針的位置，從而準(zhǔn)確地進行基因定位。143）原位雜交的特點：154）原位雜交的步驟

制備中期染色體

DNA原位變性

變性放射性或非放射性標(biāo)記探針

雜交（在載玻片上）

洗膜

放射性標(biāo)記：放射自顯影

檢測非放射性標(biāo)記：熒光染料與抗體或蛋白結(jié)合記錄雜交信號結(jié)合染色體形態(tài)進行基因定位154）原位雜交的步驟制備中期染色體165）熒光原位雜交

（florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）

用特殊熒光素（dig或Biotin）標(biāo)記探針DNA（Nicktranslation標(biāo)記法），變性成單鏈后與變性后的染色體或細胞核靶DNA雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。FISH優(yōu)點：可用來作基因或特定DNA片段的染色體區(qū)域定位。缺點：必須在已知探針的情況下方可進行。165）熒光原位雜交

（florescenceinsit17單色FISH17單色FISH18

多色FISH18多色FISH193.連鎖分析（Linkageanalysis）1）概念：基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點進行定位。193.連鎖分析（Linkageanalysis）1）概念202）重組值（recombinationfraction）是基因定位時兩個基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）3）遺傳標(biāo)記（geneticmarker）用連鎖分析發(fā)法進行基因定位需要已知的記憶內(nèi)作為遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德爾方式遺傳，標(biāo)記位點應(yīng)是多態(tài)的。202）重組值（recombinationfraction212122致病基因和標(biāo)記座的連鎖22致病基因和標(biāo)記座的連鎖23遺傳多態(tài)性：是指在一個遺傳座位上具有一個以上的等位基因，且各個等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。常用的遺傳標(biāo)記：

①ABO血型蛋白多態(tài)

②血清蛋白泳動學(xué)改變

③HLA

④RFLP小衛(wèi)星DNA：VNTR6-12個核苷酸DNA多態(tài)

⑤VNTR微衛(wèi)星DNA：STR2-6個的VNTR

⑥SNPs23遺傳多態(tài)性：是指在一個遺傳座位上具有一個以上的等位基因，24

二、基因克隆致病基因克隆有兩種基本策略功能克隆定位克隆

1、功能克隆(functionalcloning)

是利用疾病已知的遺傳損傷而引起的生化功能如蛋白質(zhì)氨基酸缺陷的信息,進行基因定位,進而克隆該基因.

24二、基因克隆252、定位克隆(positionalcloning)

是先進行基因定位作圖,然后找到來自該定位區(qū)的基因并進行克隆,在此之后才能明確該基因的功能.

功能克隆和定位克隆的比較:

在傳統(tǒng)的功能克隆中,基因功能的研究先于基因鑒定.在定位克隆中,基因定位在先,最后再鑒定基因.基因已鑒定后,可以進行基因功能的選擇性研究.

252、定位克隆(positionalclonin262627

定位克隆鑒定的第一批基因利用了特定基因座的染色體畸變，Duchenne肌營養(yǎng)不良(DMD)基因的克隆是一個重要的例子。2728假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(DMD/BMD)

由于抗肌萎縮蛋白(dystrophin)遺傳性缺陷所致的進行性肌萎縮的致死性神經(jīng)肌肉性遺傳病,發(fā)病率為1/3500，XR遺傳。

主要癥狀:通常3---5歲發(fā)病,開始走路不穩(wěn),鴨型步態(tài),上樓梯困難,Gower征陽性.進行性肌萎縮伴有腓腸肌假性肥大,10多歲下肢癱,一般在20多歲之前死于心衰或呼吸衰竭.28假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(DMD/BMD)

由于抗肌29DMD基因克隆的方法

研究者們通過對幾個女性患者的細胞遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)每個病例受累的常染色體不同但在X染色體上的斷裂點總是p21。同時一個無任何遺傳缺陷家族史的男孩被發(fā)現(xiàn)患有DMD等4種X連鎖隱性遺傳病，在這個獨一無二個體的引發(fā)下，經(jīng)過仔細的遺傳學(xué)研究，最終發(fā)現(xiàn)了Xp21.1的微小缺失。29DMD基因克隆的方法研究者們通過對幾個女性患者30DMD女性患者的核型30DMD女性患者的核型31X染色體與常染色體易位時X染色體失活的結(jié)果31X染色體與常染色體易位時X染色體失活的結(jié)果32兩個研究小組分別采用兩種不同的方法克隆了DMD基因：一組是通過X常染色體易位，克隆了該基因的一部分。另一研究組使用有Xp21.1微小缺失的男孩的DNA，利用消減技術(shù)，獲得了在正常X染色體存在而在這個男孩DNA中缺乏的DNA克隆片段。32兩個研究小組分別采用兩種不同的方法克隆了DMD基因：33一名患有DMD等4種X連鎖隱性遺傳病的男孩存在Xp21.2的微小臂內(nèi)缺失33一名患有DMD等4種X連鎖隱性遺傳病的男孩存在Xp21.34多重PCR篩查抗肌萎縮蛋白基因缺失34多重PCR篩查抗肌萎縮蛋白基因缺失35第四節(jié)基因定位常用的方法Wilson于1911年將紅綠色盲基因首次定位于X染色體上,開創(chuàng)了人類基因定位的先河.1968年,Donahue利用系譜分析的方法將Duffy血型基因定位于1號染色體上,是人類首次在常染色體上進行的基因定位.20世紀(jì)70年代后,體細胞雜交重組DNA、分子雜交和PCR等技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，基因定位的方法愈加先進，基因定位的速度、數(shù)量明顯加快。人類基因組計劃的實施和完成，更加促進了基因定位的進程?；蚨ㄎ粚μ岣呷祟悓膊‘a(chǎn)生的病因?qū)W的認識有重要意義。1第四節(jié)基因定位常用的方法Wilson于1911年36

明確幾個基本概念基因：DNA的功能片段?；蚪M：有機體全部DNA序列（它包括基因外的非基因DNA序列），它是基因和非基因DNA序列的總和?；蚨ㄎ唬菏怯靡欢ǖ姆椒▽⒒虼_定到染色體的實際位置。2明確幾個基本概念基37遺傳做圖：是以研究家族的減數(shù)分裂，以了解兩個基因分離趨勢為基礎(chǔ)來繪制基因座位間的距離，它表明基因之間連鎖關(guān)系和相對距離，并以重組率來計算和表示，以厘摩（cM）為單位。染色體定位：只把基因定位到某條染色體上。細胞水平上的基因圖又稱細胞遺傳圖區(qū)域定位：從細胞遺傳學(xué)水平，用染色體顯帶等技術(shù)在光學(xué)顯微鏡下觀察，將基因定位到染色體的具體區(qū)帶。3遺傳做圖：是以研究家族的減數(shù)分裂，以了解兩個基因分離趨勢為38一、基因定位的方法1、體細胞雜交法基因定位：體細胞：即生物體除生殖細胞外的任一細胞。1）體細胞雜交的概念：也稱細胞融合（cellinfusion），是將來源不同的兩種細胞融合成一個新細胞。新產(chǎn)生的細胞稱雜種細胞（hybridcell），含雙親不同的染色體。4一、基因定位的方法1、體細胞雜交法基因定位：39

2）對象：人的細胞鼠類：大鼠、小鼠、倉鼠

3）雜種細胞的特點：在繁殖傳代過程中，人的染色體優(yōu)先丟失，以至最后只剩幾條或一條人的染色體，而嚙齒類的染色體被保留下來。52）對象：人的細胞404）原理：細胞進行融合時，培養(yǎng)液中只有部分細胞融合成雜種細胞，還有大量未融合的雙親細胞。這就需要選擇分離純化雜種細胞。為此要創(chuàng)造一種只讓雜種細胞生長繁殖而親本細胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細胞和親本細胞對生長條件的要求和代謝的差異來進行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。64）原理：41HAT選擇系統(tǒng)：

人的突變細胞株：缺乏HGPRT酶小鼠細胞株：缺乏TK酶兩者融合培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中

HAT培養(yǎng)基：

H為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）

A可阻斷正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）

T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料7HAT選擇系統(tǒng)：人的突變細胞株：缺乏HG42因此在HAT培養(yǎng)基上

人細胞：①由于A的存在，正常的DNA合成通路受阻。②同時由于HGPRT的缺乏，無法利用次黃嘌呤通過旁路合成DNA（嘌呤合成障礙）

8因此在HAT培養(yǎng)基上人細胞：43鼠細胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黃嘌呤合成腺嘌呤，鳥嘌呤，但由于無TK，無法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障礙）

雜種細胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鳥嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）

9鼠細胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT44

將篩選出來的雜種細胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫學(xué)特性，Miller等運用體細胞雜交并結(jié)合雜種細胞的特征，證明雜種細胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17號染色體的雜種細胞都因有TK活性而存活，反之則死亡，從而推斷TK基因定位于17號染色體上，這是首例應(yīng)用體細胞雜交法進行的基因定位。10將篩選出來的雜種細胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培45鼠人XTK-HPRT+TK+HPRT-鼠人鼠人鼠人TK+HPRT+173173173TK+TK+TK-HAT11鼠人XTK-TK+鼠人鼠人鼠人TK+1731731746②克隆嵌板法(clonepanelmethod)

根據(jù)不同雜種細胞保留或丟失的人染色體有時是重疊的情況,設(shè)計的一種簡便而實用的基因定位方法。

克隆嵌板

雜種克隆保留的人染色體

12345678A++++----B++--++--C+-+-+-+-12②克隆嵌板法(clonepanelmethod)472.原位雜交和熒光原位雜交

1）原位雜交（insituhybridization）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物學(xué)技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，胰島素基因用此方法定位于11p15。

2）原理：堿基的互補配對，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA雙鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA或與mRNA互補的cDNA作探針，可檢測細胞基因組中的同源部分。132.原位雜交和熒光原位雜交483）原位雜交的特點：雜交在載玻片上的中期染色體上進行，而不是在溶液和膜上進行。所謂原位是指在標(biāo)本上DNA原位變性，再與放射性或非放射性物質(zhì)（通常用3H）標(biāo)記的已知核酸探針雜交，通過放射自顯影來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強度來確定探針的位置，從而準(zhǔn)確地進行基因定位。143）原位雜交的特點：494）原位雜交的步驟

制備中期染色體

DNA原位變性

變性放射性或非放射性標(biāo)記探針

雜交（在載玻片上）

洗膜

放射性標(biāo)記：放射自顯影

檢測非放射性標(biāo)記：熒光染料與抗體或蛋白結(jié)合記錄雜交信號結(jié)合染色體形態(tài)進行基因定位154）原位雜交的步驟制備中期染色體505）熒光原位雜交

（florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）

用特殊熒光素（dig或Biotin）標(biāo)記探針DNA（Nicktranslation標(biāo)記法），變性成單鏈后與變性后的染色體或細胞核靶DNA雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。FISH優(yōu)點：可用來作基因或特定DNA片段的染色體區(qū)域定位。缺點：必須在已知探針的情況下方可進行。165）熒光原位雜交

（florescenceinsit51單色FISH17單色FISH52

多色FISH18多色FISH533.連鎖分析（Linkageanalysis）1）概念：基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點進行定位。193.連鎖分析（Linkageanalysis）1）概念542）重組值（recombinationfraction）是基因定位時兩個基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）3）遺傳標(biāo)記（geneticmarker）用連鎖分析發(fā)法進行基因定位需要已知的記憶內(nèi)作為遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德爾方式遺傳，標(biāo)記位點應(yīng)是多態(tài)的。202）重組值（recombinationfraction552156致病基因和標(biāo)記座的連鎖22致病基因和標(biāo)記座的連鎖57遺傳多態(tài)性：是指在一個遺傳座位上具有一個以上的等位基因，且各個等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。常用的遺傳標(biāo)記：

①ABO血型蛋白多態(tài)

②血清蛋白泳動學(xué)改變

③HLA

④RFLP小衛(wèi)星DNA：VNTR6-12個核苷酸DNA多態(tài)

⑤VNTR微衛(wèi)星DNA：STR2-6個的VNTR

⑥SNPs23遺傳多態(tài)性：是指在一個遺傳座位上具有一個以上的等位基因，58

二、基因克隆致病基因克隆有兩種基本策略功能克隆定位克隆

1、功能克隆(functionalcloning)

是利用疾病已知的遺傳損傷而引起的生化功能如蛋白質(zhì)氨基酸缺陷的信息,進行基因定位,進而克隆該基因.

24二、基因克隆592