水中細菌總數(shù)與大腸菌群的測定一實驗目的1、掌握細菌總數(shù)的測定方法2、掌握大腸桿菌的鑒定和計數(shù)方法3、鞏固無菌操作技術

1.細菌總數(shù)測定原理

用營養(yǎng)瓊脂傾注平板，測定被檢物在單位重量或體積（g或ml）內所含有的活細菌數(shù)量，以判明被檢物被細菌污染的程度。二實驗原理

細菌學檢驗程序

樣品

細菌總數(shù)

大腸菌群

水樣稀釋或不稀釋

水樣稀釋或不稀釋第一步------初步發(fā)酵試驗傾注平板培養(yǎng)（乳糖發(fā)酵）

37℃24小時37℃24小時

菌落計數(shù)第二步------平板分離培養(yǎng)（取平均數(shù)報告）（轉種鑒別培養(yǎng)基）

37℃24小時革蘭染色鏡檢第三步-------乳糖復發(fā)酵試驗

報告結果

三、實驗器材

1、恒溫培養(yǎng)箱（36℃±1℃）、恒溫水浴鍋（46℃±1℃）、天平、滅菌培養(yǎng)皿、試管。

2、培養(yǎng)基及試劑：乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍瓊脂平板（EMB）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1.以1ml無菌吸管吸取樣品1ml加入9ml無菌生理鹽水，使樣品（自來水、飲用水、飲料等）成1：10、1：100、1：1000等幾個稀釋度；樣品（下水道水、牛奶）稀釋度要適當高。

2.分別在無菌平皿內加入1：100、1：10、原樣的樣品各1ml，每個稀釋度均做一個平板。注意：先加濃度低的樣品，再加濃度高的樣品3.將冷卻45℃的營養(yǎng)瓊脂傾注于平皿中，搖勻，置37℃培養(yǎng)24小時。

四、實驗步驟-細菌總數(shù)測定平皿分4部分點數(shù)（見圖）求同一稀釋度的平均菌落數(shù)如：A1數(shù)+A2數(shù)+A33

4、菌落計數(shù)：

★稀釋度的選擇：

1.應選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之

2.若有兩個稀釋度其生長之菌落數(shù)均在30-300，則應視二者之比如何來決定，若其比值小于2，應報告平均數(shù)。若其比值大于2則報告其中較小的數(shù)字。

3.若所有平均菌落數(shù)均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。

稀釋度選擇及細菌總數(shù)報告方法稀釋液及菌落數(shù)

10-110-210-3

11,36516420—16，400

16，000或1.6×10422,760295461.6

37，750

38，000或3.8×10432,890271602.2

27，100

27，000或2.7×1044不可計4，650513—513，000510，000或5.1×105527115—270

270或2.7×1026不可計30512—30，50031，000或3.1×1047不可計不可計不可計—10-3無法計數(shù)

稀釋倍數(shù)

平均

菌落數(shù)例次兩稀釋度

菌落數(shù)之比細菌總數(shù)(個/g或個/ml)

報告方式(個/g或個/ml)五、大腸菌群的檢測

檢品膽鹽乳糖發(fā)酵管伊紅美蘭平板大腸桿菌菌落純培養(yǎng)乳糖復發(fā)酵管（-）乳糖復發(fā)酵管（⊕）1、檢樣稀釋①以無菌操作將檢樣1mL放于含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內，經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。②用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，注入含有9mL生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混勻，做成1：100的稀釋液。③另取1ml滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液。④根據(jù)食品衛(wèi)生要求或對檢驗樣品污染情況估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度，接種3管，每支試管接種1ml。2.乳糖發(fā)酵試驗

將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1mL及1mL以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個稀釋度接種3管，置36℃±1℃溫箱內，培養(yǎng)24h±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產生者，則按下列程續(xù)進行。3.分離培養(yǎng)

將產氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36℃±1℃溫箱內，培養(yǎng)18h—24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)并做革蘭氏染色和證實試驗。4.證實試驗在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1—2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36℃±1℃的溫箱內培養(yǎng)24h±2h，觀察產氣情況。凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌，即報告為大腸菌群陽性。5.報告根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100mL（g）食品中大腸菌群的MPN

值。表1大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表

陽性管數(shù)MPN100mL(g）95%可信限1mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×3

下限

上限

0000

0000

0123

<30306090

<5

90

0000

1111

0123

306090120

<5

1300000222201236090120160000033330123901301601901111000001234070110150<510200210111111110123701101501901030230360111122220123110150