微生物培養(yǎng)與應(yīng)用B主要內(nèi)容：大腸桿菌的純化培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解纖維素微生物的分離微生物培養(yǎng)與應(yīng)用B主要內(nèi)容：類型具體內(nèi)容微生物的培養(yǎng)利用微生物的培養(yǎng)與分離某種微生物數(shù)量的測定培養(yǎng)基對微生物的選擇作用利用微生物進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)特定的產(chǎn)物發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的測定技術(shù)方法利用考綱要求：微生物的培養(yǎng)和利用大腸桿菌的純化培養(yǎng)類型具體內(nèi)容微生微生物的培養(yǎng)與分離某種微生物數(shù)量的測定培養(yǎng)基大腸桿菌的純化培養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：培養(yǎng)基用量依配方計(jì)算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補(bǔ)水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿分散成單個細(xì)胞,形成單個菌落大腸桿菌的純化培養(yǎng)1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至10倒平板約50℃防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基大腸桿菌的純化培養(yǎng)倒平板約50℃防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：⑴平板劃線法：菌種劃3個平板1個不劃線1.接種：接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（空白對照）大腸桿菌的純化培養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿平板劃線法大腸桿菌的純化培養(yǎng)平板劃線法大腸桿菌的純化培養(yǎng)問題討論為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。大腸桿菌的純化培養(yǎng)問題討論為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液微量移液器大腸桿菌的純化培養(yǎng)6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml大腸桿菌的純化培養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼試涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍大腸桿菌的純化培養(yǎng)⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.⑴平板劃線法：大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：1.接種：⑵稀釋涂布平板法：2.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄大腸桿菌的純化培養(yǎng)⑴平板劃線法：大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)菌種的保藏：1.臨時(shí)保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃大腸桿菌的純化培養(yǎng)菌種的保藏：1.臨時(shí)保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長期保分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)尿素[CO(NH2)2]——重要的農(nóng)業(yè)氮肥。只能被土壤中細(xì)菌分解為NH3才能被植物吸收利用CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3細(xì)菌脲酶分離產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)尿素[CO(NH2)2]——重要的農(nóng)業(yè)氮肥。細(xì)菌脲酶分離產(chǎn)生篩選菌株提出的問題

—如何尋找耐高溫的酶？解決問題的思路—尋找耐高溫環(huán)境；原理—高溫淘汰其他菌，選出耐高溫細(xì)菌，耐高溫菌種提取耐高溫酶。分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)篩選菌株分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)篩選菌株

KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4

H2O0.2g

葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1000mL。該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？

此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？?碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌能利用尿素作為氮源而生存。分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)篩選菌株

KH2PO41.4g該培篩選菌株

1、選擇培養(yǎng)基：

允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。2、菌株：

純且活狀態(tài)所保存的菌種。分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)篩選菌株

1、選擇培養(yǎng)基：分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：

1、活體計(jì)數(shù)法（稀釋涂布平板）（1）操作方法：

稀釋涂布平板→統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)（2）原理：1個菌落→1個活菌（3）統(tǒng)計(jì)原則

①選30～300個菌落的平板統(tǒng)計(jì)

②每個稀釋度取3個平板取其平均值為什么？分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：為什么？分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230。

2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？甲：沒有重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布3個平板）

乙：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值?分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同甲：沒統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目

1、活菌計(jì)數(shù)法（4）統(tǒng)計(jì)結(jié)果：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低，因此統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)表示。每克樣品中的菌株數(shù)=（C/V)*MC:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V:所用稀釋液的體積；M:稀釋倍數(shù)。為什么？分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目為什么？分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)2、顯微觀察法：比例計(jì)數(shù)或直接計(jì)數(shù)（血球計(jì)數(shù)板）計(jì)數(shù)室（中央大方格）的長、寬和高分別為：1mm

、1mm和0.1mm計(jì)數(shù)室的容積：0.1mm3

（萬分之一毫升）取樣：稀釋一定倍數(shù)的菌液分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)2、顯微觀察法：比例計(jì)數(shù)或直接計(jì)數(shù)（血球計(jì)數(shù)板）計(jì)數(shù)室（中央分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)酵母細(xì)胞數(shù)/ml＝80小格內(nèi)酵母細(xì)胞個數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)順序：左上→右上→右下→左下壓在格線的，只統(tǒng)計(jì)左線和上線3.稱重法：一個細(xì)胞（細(xì)菌）一般重約10－12～10－13g分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)酵母細(xì)胞數(shù)/ml＝80小格內(nèi)酵母細(xì)胞個數(shù)/80×400×104.比濁法記數(shù)

當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)到107個/ml時(shí),培養(yǎng)基會渾濁4.比濁法記數(shù)當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)到107個/ml時(shí),培養(yǎng)基會渾濁利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行尿素分解菌的分離過程中，從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，A、B兩同學(xué)分別得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。1、A同學(xué)篩選出150個菌落。

2、B同學(xué)篩選出50個菌落。B認(rèn)為A的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細(xì)菌也能在該培養(yǎng)基中生長。A確認(rèn)自己的操作無誤，但也拿不出能令人信服的證據(jù)。

請你幫助A同學(xué)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，提供具有說明了的證據(jù)。設(shè)置對照—同等條件下，培養(yǎng)空白培養(yǎng)基?分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行尿素分解菌的分離過程中，從對應(yīng)稀設(shè)置對照

1、設(shè)置對照的目的：排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。對照實(shí)驗(yàn)是指除了

被測試

的條件外，其他條件都

相同

的實(shí)驗(yàn)。滿足該條件的稱為

對照組，未滿足該條件的稱為

實(shí)驗(yàn)

組。分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)設(shè)置對照分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)尿素培養(yǎng)基未接種的尿素培養(yǎng)基10-510-4分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)尿素培養(yǎng)基未接種的尿素培養(yǎng)基10-510-4分解尿素的細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)過程

（一）土壤取樣

1、取樣的位置：土壤，天然培養(yǎng)基，含有大量的微生物，其中70～90％是細(xì)菌。在富含有機(jī)質(zhì)的土壤層的3～8cm處中分布著絕大多數(shù)的細(xì)菌。

2、取樣要求：鏟去表層土。

菌落計(jì)數(shù)配制土壤溶液系列稀釋涂布平板與培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)過程（一）土壤取樣

菌落計(jì)數(shù)配制土壤溶液系列稀釋（二）樣品稀釋（1）測細(xì)菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液（2）測放線菌：一般用103、104、105稀釋液（3）測真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液原則：確保平板上的菌落數(shù)在30～300之間。（三）微生物的培養(yǎng)與觀察

1、接種：用適當(dāng)?shù)南♂屢鹤魍坎计桨?/p>

2、培養(yǎng)：細(xì)菌：30～37℃，1～2d;

放線菌:25～28℃,5～7d;

霉菌:25～28℃,3～4d.3、觀察：a.每24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目

b.以“穩(wěn)定菌落”為觀察對象

分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)（二）樣品稀釋分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)（四）鑒定鑒別培養(yǎng)基：不影響微生物的生存酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細(xì)菌原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→酚紅變紅→脲酶陽性分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)（四）鑒定分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解纖維素微生物的分離分解纖維素微生物的分離纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素纖維二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶分解纖維素微生物的分離背景知識纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種濾紙崩潰法纖維素酶活性的測定實(shí)驗(yàn)：分解纖維素微生物的分離背景知識濾紙崩潰法纖維素酶活性的測定實(shí)驗(yàn)：分解纖維素微生物的分離背景剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。分解纖維素微生物的分離背景知識剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖實(shí)驗(yàn)流程示意圖實(shí)驗(yàn)流程示意圖37一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?shí)驗(yàn)原理三、所需儀器、材料、用具和藥品四、實(shí)驗(yàn)的方法和步驟五、分析結(jié)果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分解纖維素微生物的分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、所需儀器、材料、用具和藥品四、實(shí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、利用特定的選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基從土壤中分離分解纖維素的微生物。2、掌握剛果紅染色的機(jī)理和操作。分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、利用特定的選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基從土壤中分離1、以纖維素為碳源的選擇培養(yǎng)基能選擇出分解纖維素的微生物。2、剛果紅可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)原理分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、以纖維素為碳源的選擇培養(yǎng)基能選擇出分解纖維素的微生物。2三、所需儀器、材料、用具和藥品1、實(shí)驗(yàn)儀器與用具除了分離分解尿素的細(xì)菌中用到的有關(guān)儀器用具外，還需要恒溫振蕩培養(yǎng)箱。2、材料與藥品分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三、所需儀器、材料、用具和藥品1、實(shí)驗(yàn)儀器與用具除了四、實(shí)驗(yàn)的方法和步驟1、配制培養(yǎng)基2、滅菌3、土壤取樣5、樣品稀釋6、涂布接種4、選擇培養(yǎng)7、篩選菌落分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)四、實(shí)驗(yàn)的方法和步驟1、配制培養(yǎng)基2、滅菌3、土壤取樣5、樣配制培養(yǎng)基分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)滅菌配制培養(yǎng)基分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)滅菌酵母膏：實(shí)際上是膏狀的酵母抽提物，酵母抽提物是國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定名稱。酵母抽提物以酵母為原料，采用自溶法或加酶水解法工藝，經(jīng)分離、脫色而成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母細(xì)胞水溶性成分的產(chǎn)品。水解酪素：微生物培養(yǎng)基的氨基酸氮源，由酪蛋白水解得到，常見商品名稱為水解酪素或酶解酪素。酪蛋白水解后富含21種氨基酸，氨基酸種類齊全。因此常用于制備培養(yǎng)基。CMC-Na：羧甲基纖維素鈉，是天然纖維素經(jīng)化學(xué)改性后得到的纖維素衍生物，是纖維素的羧甲基醚化物。分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)酵母膏：實(shí)際上是膏狀的酵母抽提物，酵母抽提物是國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的44思考：1.為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？2.將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？土壤取樣將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思考：土壤取樣將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚“濃縮”作用將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下振蕩培養(yǎng)1-2d，直至培養(yǎng)液變混濁。吸取一定量的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至另一瓶新鮮的選擇培養(yǎng)基中，以同樣的方法培養(yǎng)到培養(yǎng)液變混濁。（富集培養(yǎng)）選擇培養(yǎng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量來確定是否需要。分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)“濃縮”作用將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐樣品稀釋分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)涂布接種鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基樣品稀釋分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)涂布接種鑒別纖維素分解挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。挑取產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可獲得純培養(yǎng)。篩選菌落分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。挑取產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，一剛果紅染色法方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。方法二：在倒平板時(shí)就加入剛果紅。分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)剛果紅染色法方法一：方法二：分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)微生物培養(yǎng)的基本程序培養(yǎng)基的配制—稱量→溶化→調(diào)pH→分裝→包扎滅菌（高壓蒸汽滅菌）接種固體培養(yǎng)基—平板劃線（接種環(huán)）、稀釋涂布（玻璃刮刀）液體培養(yǎng)基—用接種環(huán)蘸取菌液（擴(kuò)大培養(yǎng)）培養(yǎng)固體培養(yǎng)基—倒置，37℃恒溫培養(yǎng)箱，24h左右液體培養(yǎng)基—空氣浴或水浴培養(yǎng)箱（搖床），震蕩培養(yǎng)固體培養(yǎng)基—劃線的末端出現(xiàn)單菌落液體培養(yǎng)基—培養(yǎng)液變渾濁觀察

廢棄菌種和培養(yǎng)基滅菌后丟棄

總結(jié)微生物培養(yǎng)的基本程序培養(yǎng)基的配制—稱量→溶化→調(diào)pH→分裝→本節(jié)課內(nèi)容結(jié)束本節(jié)課內(nèi)容結(jié)束51微生物培養(yǎng)與應(yīng)用B主要內(nèi)容：大腸桿菌的純化培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解纖維素微生物的分離微生物培養(yǎng)與應(yīng)用B主要內(nèi)容：類型具體內(nèi)容微生物的培養(yǎng)利用微生物的培養(yǎng)與分離某種微生物數(shù)量的測定培養(yǎng)基對微生物的選擇作用利用微生物進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)特定的產(chǎn)物發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的測定技術(shù)方法利用考綱要求：微生物的培養(yǎng)和利用大腸桿菌的純化培養(yǎng)類型具體內(nèi)容微生微生物的培養(yǎng)與分離某種微生物數(shù)量的測定培養(yǎng)基大腸桿菌的純化培養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：培養(yǎng)基用量依配方計(jì)算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補(bǔ)水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿分散成單個細(xì)胞,形成單個菌落大腸桿菌的純化培養(yǎng)1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至10倒平板約50℃防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基大腸桿菌的純化培養(yǎng)倒平板約50℃防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：⑴平板劃線法：菌種劃3個平板1個不劃線1.接種：接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（空白對照）大腸桿菌的純化培養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿平板劃線法大腸桿菌的純化培養(yǎng)平板劃線法大腸桿菌的純化培養(yǎng)問題討論為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。大腸桿菌的純化培養(yǎng)問題討論為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液微量移液器大腸桿菌的純化培養(yǎng)6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml大腸桿菌的純化培養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼試涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍大腸桿菌的純化培養(yǎng)⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.⑴平板劃線法：大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：1.接種：⑵稀釋涂布平板法：2.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄大腸桿菌的純化培養(yǎng)⑴平板劃線法：大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)菌種的保藏：1.臨時(shí)保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃大腸桿菌的純化培養(yǎng)菌種的保藏：1.臨時(shí)保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長期保分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)尿素[CO(NH2)2]——重要的農(nóng)業(yè)氮肥。只能被土壤中細(xì)菌分解為NH3才能被植物吸收利用CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3細(xì)菌脲酶分離產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)尿素[CO(NH2)2]——重要的農(nóng)業(yè)氮肥。細(xì)菌脲酶分離產(chǎn)生篩選菌株提出的問題

—如何尋找耐高溫的酶？解決問題的思路—尋找耐高溫環(huán)境；原理—高溫淘汰其他菌，選出耐高溫細(xì)菌，耐高溫菌種提取耐高溫酶。分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)篩選菌株分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)篩選菌株

KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4

H2O0.2g

葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1000mL。該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？

此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？?碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌能利用尿素作為氮源而生存。分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)篩選菌株

KH2PO41.4g該培篩選菌株

1、選擇培養(yǎng)基：

允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。2、菌株：

純且活狀態(tài)所保存的菌種。分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)篩選菌株

1、選擇培養(yǎng)基：分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：

1、活體計(jì)數(shù)法（稀釋涂布平板）（1）操作方法：

稀釋涂布平板→統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)（2）原理：1個菌落→1個活菌（3）統(tǒng)計(jì)原則

①選30～300個菌落的平板統(tǒng)計(jì)

②每個稀釋度取3個平板取其平均值為什么？分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：為什么？分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230。

2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？甲：沒有重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布3個平板）

乙：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值?分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同甲：沒統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目

1、活菌計(jì)數(shù)法（4）統(tǒng)計(jì)結(jié)果：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低，因此統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)表示。每克樣品中的菌株數(shù)=（C/V)*MC:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V:所用稀釋液的體積；M:稀釋倍數(shù)。為什么？分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目為什么？分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)2、顯微觀察法：比例計(jì)數(shù)或直接計(jì)數(shù)（血球計(jì)數(shù)板）計(jì)數(shù)室（中央大方格）的長、寬和高分別為：1mm

、1mm和0.1mm計(jì)數(shù)室的容積：0.1mm3

（萬分之一毫升）取樣：稀釋一定倍數(shù)的菌液分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)2、顯微觀察法：比例計(jì)數(shù)或直接計(jì)數(shù)（血球計(jì)數(shù)板）計(jì)數(shù)室（中央分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)酵母細(xì)胞數(shù)/ml＝80小格內(nèi)酵母細(xì)胞個數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)順序：左上→右上→右下→左下壓在格線的，只統(tǒng)計(jì)左線和上線3.稱重法：一個細(xì)胞（細(xì)菌）一般重約10－12～10－13g分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)酵母細(xì)胞數(shù)/ml＝80小格內(nèi)酵母細(xì)胞個數(shù)/80×400×104.比濁法記數(shù)

當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)到107個/ml時(shí),培養(yǎng)基會渾濁4.比濁法記數(shù)當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)到107個/ml時(shí),培養(yǎng)基會渾濁利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行尿素分解菌的分離過程中，從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，A、B兩同學(xué)分別得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。1、A同學(xué)篩選出150個菌落。

2、B同學(xué)篩選出50個菌落。B認(rèn)為A的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細(xì)菌也能在該培養(yǎng)基中生長。A確認(rèn)自己的操作無誤，但也拿不出能令人信服的證據(jù)。

請你幫助A同學(xué)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，提供具有說明了的證據(jù)。設(shè)置對照—同等條件下，培養(yǎng)空白培養(yǎng)基?分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行尿素分解菌的分離過程中，從對應(yīng)稀設(shè)置對照

1、設(shè)置對照的目的：排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。對照實(shí)驗(yàn)是指除了

被測試

的條件外，其他條件都

相同

的實(shí)驗(yàn)。滿足該條件的稱為

對照組，未滿足該條件的稱為

實(shí)驗(yàn)

組。分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)設(shè)置對照分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)尿素培養(yǎng)基未接種的尿素培養(yǎng)基10-510-4分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)尿素培養(yǎng)基未接種的尿素培養(yǎng)基10-510-4分解尿素的細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)過程

（一）土壤取樣

1、取樣的位置：土壤，天然培養(yǎng)基，含有大量的微生物，其中70～90％是細(xì)菌。在富含有機(jī)質(zhì)的土壤層的3～8cm處中分布著絕大多數(shù)的細(xì)菌。

2、取樣要求：鏟去表層土。

菌落計(jì)數(shù)配制土壤溶液系列稀釋涂布平板與培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)過程（一）土壤取樣

菌落計(jì)數(shù)配制土壤溶液系列稀釋（二）樣品稀釋（1）測細(xì)菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液（2）測放線菌：一般用103、104、105稀釋液（3）測真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液原則：確保平板上的菌落數(shù)在30～300之間。（三）微生物的培養(yǎng)與觀察

1、接種：用適當(dāng)?shù)南♂屢鹤魍坎计桨?/p>

2、培養(yǎng)：細(xì)菌：30～37℃，1～2d;

放線菌:25～28℃,5～7d;

霉菌:25～28℃,3～4d.3、觀察：a.每24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目

b.以“穩(wěn)定菌落”為觀察對象

分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)（二）樣品稀釋分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)（四）鑒定鑒別培養(yǎng)基：不影響微生物的生存酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細(xì)菌原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→酚紅變紅→脲酶陽性分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)（四）鑒定分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)分解纖維素微生物的分離分解纖維素微生物的分離纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素纖維二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶分解纖維素微生物的分離背景知識纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種濾紙崩潰法纖維素酶活性的測定實(shí)驗(yàn)：分解纖維素微生物的分離背景知識濾紙崩潰法纖維素酶活性的測定實(shí)驗(yàn)：分解纖維素微生物的分離背景剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。分解纖維素微生物的分離背景知識剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖實(shí)驗(yàn)流程示意圖實(shí)驗(yàn)流程示意圖88一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、所需儀器、材料、用具和藥品四、實(shí)驗(yàn)的方法和步驟五、分析結(jié)果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分解纖維素微生物的分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、所需儀器、材料、用具和藥品四、實(shí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、利用特定的選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基從土壤中分離分解纖維素的微生物。2、掌握剛果紅染色的機(jī)理和操作。分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、利用特定的選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基從土壤中分離1、以纖維素為碳源的選擇培養(yǎng)基能選擇出分解纖維素的微生物。2、剛果紅可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)原理分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、以纖維素為碳源的選擇培養(yǎng)基能選擇出分解纖維素的微生物。2三、所需儀器、材料、用具和藥品1、實(shí)驗(yàn)儀器與用具除了分離分解尿素的細(xì)菌中用到的有關(guān)儀器用具外，還需要恒溫振蕩培養(yǎng)箱。2、材料與藥品分解纖維素微生物的分離實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三、所需儀器、材料、用具和藥品1、實(shí)驗(yàn)儀器與用具除了四、實(shí)驗(yàn)的