園藝作物病蟲(chóng)害防治學(xué)習(xí)情境1蔬菜病蟲(chóng)害防治子學(xué)習(xí)情境2:侵染性病害防治

病原真菌的分離與培養(yǎng)一、目的要求掌握病原真菌分離培養(yǎng)的基本原理、學(xué)會(huì)消毒、滅菌、倒平板、病原真菌的組織分離和稀釋分離的基本方法。二、材料、用具和藥品新鮮的真菌病害分離材料、PDA的斜面與平板培養(yǎng)基、無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)或無(wú)菌操作箱（接種箱）、恒溫箱、紫外線(xiàn)滅菌燈、酒精燈、火柴、吸管、剪刀、鑷子、接種環(huán)、接種針、福爾馬林、70%乙醇、0.1%升汞、無(wú)菌水和記號(hào)筆等。三、內(nèi)容與方法分離是將病原物從發(fā)病組織上與其他微生物分開(kāi)；培養(yǎng)是將分離的病原物移到可以讓這種病原物正常生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)（培養(yǎng)基）上，從而獲得其純培養(yǎng)。（一）分離前的準(zhǔn)備工作1.工作環(huán)境和分離用具的清潔和消毒（1）常用的消毒方法：（2）清潔和消毒工作環(huán)境為了避免污染，分離工作要求在無(wú)菌條件下進(jìn)行，無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)或無(wú)菌操作箱（接種箱）是分離工作不可缺少的設(shè)施。在分離前，無(wú)菌室內(nèi)用紫外燈照射20-30min，以殺死室內(nèi)空氣中的大多數(shù)細(xì)菌。無(wú)菌操作箱可在分離前用化學(xué)消毒劑清除箱內(nèi)微生物。若分離工作只能在普通房間進(jìn)行時(shí)，必須對(duì)房間進(jìn)行徹底清潔，關(guān)閉門(mén)窗，避免空氣流動(dòng)，經(jīng)過(guò)噴霧或在地上多灑些水，以除去空氣及地面灰塵后進(jìn)行操作，也可獲得較好的結(jié)果。工作前擦凈桌面，最好鋪上濕毛巾自認(rèn)清潔或紗布上，盡量避免工作過(guò)程中臨時(shí)取物帶來(lái)污染。工作人員要注意清潔，工作前用肥皂洗手，分離前還要用70%乙醇擦拭雙手。（3）消毒分離用具凡是和分離材料接觸的器皿和材料都要保持無(wú)菌。將分離用具浸于70%乙醇中，使用時(shí)在燈焰上燒去乙醇滅菌，如此3次（刀、剪、鑷等不宜燒時(shí)過(guò)長(zhǎng)，以防退火），再次使用時(shí)必須重復(fù)滅菌。2、選擇分離材料分離材料應(yīng)盡量新鮮，減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。從受病組織邊緣靠近健全組織的部分分離，可減少污染，同時(shí)這部分病原生物處于較為活躍的狀態(tài)，生長(zhǎng)快，易分離成功。四、病原真菌的分離方法：（一）組織分離法：

1.培養(yǎng)皿準(zhǔn)備：取滅菌培養(yǎng)皿一個(gè)，置于濕紗布上，在皿蓋上注明分離日期、材料和分離人姓名。2.培養(yǎng)皿平板制作：無(wú)菌操作法向培養(yǎng)皿中加入25%乳酸1-2滴（減少細(xì)菌污染），然后將熔化而冷至45℃左右的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，輕輕搖成平面（分離細(xì)菌時(shí)則不能加乳酸）。馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）的制作：配方：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，水1000mL，pH值自然。（1）稱(chēng)量和熬煮：藥品實(shí)際用量計(jì)算后，按培養(yǎng)基配方逐一稱(chēng)取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000ml，在加熱器上加熱至沸騰，維持20－30min，用可用2層紗布趁熱在量杯上過(guò)濾，濾渣棄取。濾液補(bǔ)充水分到1000ml。（2）加熱溶解：把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂15～20g（提前搞碎），然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補(bǔ)充水分至所需量。（3）分裝：按實(shí)驗(yàn)要求，將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或500ml三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上造成污染。高壓滅菌鍋操作過(guò)程

加水裝鍋蓋蓋加熱當(dāng)壓力升為0.5kg/cm2時(shí)排放冷空氣正式升壓保壓（1.1kg/cm2，121℃，保持20-30min）停止加熱自然降壓至零排放余汽開(kāi)蓋取出滅菌物品趁熱擺斜面檢驗(yàn)滅菌效果。約50℃倒平板灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染

果實(shí)、塊莖和枝桿等組織內(nèi)部的病原菌可用脫脂棉蘸70%酒精涂拭病部表面，通過(guò)火焰燒去表面酒精，重復(fù)進(jìn)行2-3次，達(dá)到表面消毒。

提示：先用70％的酒精浸2、3s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70％的酒精亦用于表面消毒，處理的時(shí)間較短(一般數(shù)秒lmin)。升汞溶液消毒的時(shí)間因材料而異，可自30s至30min不等，一般情況下，需時(shí)間3，5min。5.接種：用無(wú)菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放4--6塊。

提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無(wú)菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染。

(6)培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿倒置放人26-28℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般3—4d后觀(guān)察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果。（7）制片觀(guān)察：用無(wú)菌操作法自培養(yǎng)皿中選擇菌落，挑取少許菌絲及孢子，在顯微鏡下觀(guān)察。若病組織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。在無(wú)菌條件下，用接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在25℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后，觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即得該分離病菌純菌種，便可置于冰箱中保存。

（二）稀釋分離法稀釋分離法主要用于在病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原菌物。先將待分離的孢子進(jìn)行梯度稀釋后，進(jìn)行分離培養(yǎng)。1.涂布平板法（1）梯度稀釋菌懸液：將待分離病原菌配制成菌懸液，再用無(wú)菌水作倍比稀釋。方法：用1mL無(wú)菌吸管吸取1mL菌懸液注入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，吹吸3次，使充分混勻。然后再用一支1mL無(wú)菌吸管從此試管中吸取1mL注入另一盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依此類(lèi)推，制成10-1、10-2、10-3、10-4等稀釋度的菌懸液。一般稀釋3-6個(gè)梯度。（2）涂布：分別用無(wú)菌吸管從最后3種稀釋度的試管中吸取0.1mL菌懸液對(duì)號(hào)放入平板上，用無(wú)菌涂布棒在培養(yǎng)基表面均勻涂布。（3）標(biāo)記：在培養(yǎng)皿底面標(biāo)記菌懸液稀釋度、分離日期和分離人姓名。（4）培養(yǎng)：將培養(yǎng)基平板倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，一般需要3-5d。（5）純化：觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況，將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別移入斜面培養(yǎng)基上，純化步驟同組織分離法。（5）將熔化并冷卻到45℃左右的培養(yǎng)基，分別倒在3個(gè)培養(yǎng)皿中，搖動(dòng)使培養(yǎng)基與稀釋的菌落充分混勻，平置冷卻凝固。（6）將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)后放入恒溫箱26-28℃中培養(yǎng)，3-4d后觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況。（7）獲純培養(yǎng)后，從菌落邊緣挑取菌絲塊移入斜面培養(yǎng)3-4d后，放入冰箱保存。（8）要獲得純凈培養(yǎng)，一般需經(jīng)3次稀釋分離（重