第五章冷凍干燥的保護劑和添加劑添加劑作用機理的幾種說法冷凍干燥配方需要注意的問題冷凍干燥配方舉例

5.6添加劑作用機理的幾種說法

1.凍結過程中低溫保護的機理

凍結過程的保護也稱為低溫保護。關于液體狀態(tài)下保護劑蛋白質穩(wěn)定的機理，目前較被接受的是Timasheff的“優(yōu)先作用”機理。在凍結過程中，蛋白質溶液大多數(shù)時間是處于溶液狀態(tài)，只有在凍結快結束時，才達到最大凍結濃度?！皟?yōu)先作用”機理認為蛋白質溶液，在達到最大凍結濃度之前，優(yōu)先與水作用（優(yōu)先水合）；而保護劑優(yōu)先被排斥在蛋白質區(qū)域外（優(yōu)先排斥）。這是由于保護劑的加入，增大了水分子的表面張力，促使了蛋白質分子優(yōu)先與水分子相互作用。在這種情況下，蛋白質分子外表面比其體相中有相對較多的水分子和相對較少的保護劑分子，從而也就保護了蛋白質的天然構象。其他機理表面張力減小機理用來解釋表面活性劑對蛋白質溶液凍結過程的保護。限制蛋白質分子擴散的機理認為許多保護劑都能夠提高溶液的黏度，抑制活性分子的擴散。2）水替代假說由于蛋白質分子中存在大量的氫鍵，結合水通過氫鍵與蛋白質分子聯(lián)結。當?shù)鞍踪|在冷凍干燥過程中失去水分后，保護劑的羥基能夠替代蛋白質表面上水的羥基，使蛋白質表面形成一層“水合層”，這樣就可以保護氫鍵的聯(lián)結位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，從而保持了蛋白質天然結構和功能的完整性。目前許多研究者比較贊同“水替代假說”的觀點，這主要是因為通過傅立葉紅外線頻譜儀（FTIR）對蛋白質分子的結構以及蛋白質與保護劑之間的氫鍵作用進行直接檢測，為該理論提供了證據(jù)。波長cm-1------天然蛋白質溶液—含有添加劑的蛋白質溶液干擾素-γ分別在冷凍干燥固體狀態(tài)和復水后的頻譜圖凍干干擾素-γ的頻譜圖。含有濃度為1M蔗糖的凍干干擾素-γ的頻譜，與天然水溶液蛋白質極為相似；而沒有蔗糖時，頻譜差異較大。在不含蔗糖的干燥樣品中，在1656cm-1處出現(xiàn)吸收率減少，表示α-螺旋結構的損失，作為補償，相應地分別在1640-1645cm-1和1665-1695cm-1處出現(xiàn)吸收率增加而轉換成β-折疊和彎曲（turns）結構。β-折疊結構的優(yōu)先出現(xiàn)，是對蛋白質與水之間氫鍵作用減少的一種補償，即代表了干燥樣品中氫鍵作用損失的最大程度。3.貯藏過程中的保護機理和冷凍干燥過程一樣，在凍干制品的長期貯藏過程中也存在著多種影響因素。兩者之間的主要區(qū)別在于時間尺度上。干燥過程中出現(xiàn)的引起蛋白質變質的時間尺度為小時；而對于貯藏而言，時間尺度為月或年。在正確的冷凍干燥工藝中，要求產品溫度接近于其玻璃化轉變溫度；而在正確的貯藏條件下，環(huán)境溫度應當比其玻璃化轉變溫度低得多，以獲得很長的松弛時間。在凍干生物制品的長期貯藏過程中，各種賦形劑對它的保護作用機理，同樣有“玻璃態(tài)假說”和“水替代假說”之爭論。5.7冷凍干燥配方需要注意的問題由于生物物料中活性組分各不相同，因而一般均須針對物料單獨配方。為了確保生物制品冷凍干燥后最大程度地獲得活性恢復率，必須充分考慮各種保護劑和添加劑與生物制品活性組分之間的最大相容性。2.緩沖劑的選擇

有許多緩沖劑能夠用于生物制品的冷凍干燥配方中，但是，并非每一種緩沖劑都能夠用于任何溶液，例如，對pH敏感的蛋白質溶液，就應當避免使用磷酸鈉緩沖劑，這是由于在凍結過程中，Na2HPO4易于優(yōu)先結晶，使得溶液的pH值降低，最終引起蛋白質變性。另外，正確選擇緩沖劑的濃度也是很重要的。例如，β-牛乳糖水溶液（2μg/ml）冷凍干燥過程中，因為甘露醇結晶而不能起到保護作用。當添加濃度為10mM的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）后，部分抑制了甘露醇的結晶，并且酶的活性達到95%；而將磷酸鹽緩沖液（pH7.4）的濃度提高到200mM就能夠完全抑制甘露醇結晶。4.低溫、干燥保護劑的選擇糖類是生物制品冷凍干燥過程中使用最頻繁的保護劑，這是因為大多數(shù)糖在正常操作條件下不會結晶。并且，一般不選用還原性糖，因為它可能與蛋白質之間發(fā)生Maillard反應。蔗糖、海藻糖是最常用的保護劑。某些聚合物，因其能提高玻璃化轉變溫度，而常被用作保護劑。但是，聚合物與蛋白質分子形成氫鍵的能力遠遠低于糖類，所以常常采用聚合物與糖聯(lián)合使用。這樣既可以提高配方的玻璃化轉變溫度，又可以與蛋白質形成很強的氫鍵作用。5.8冷凍干燥配方舉例一般來講，蛋白質配方中固體成分含量在2%-10%之間。當固體含量低于2%時，不能形成結實的凍干產品；而固體含量高于10%時，又不能很好地進行冷凍干燥，即使冷凍干燥完成，也會給復水帶來困難。由于添加劑之間的物理作用是相互的，因此保持各添加劑之間的相對合適含量是很重要的。如果某種添加劑同時能起到幾種