大腸桿菌的培養(yǎng)與分離實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作2.進(jìn)行大腸桿菌的分離,用固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理大腸桿菌為革蘭氏陰性桿菌，對(duì)鏈霉素敏感兼性厭氧基因工程的常用受體細(xì)胞培養(yǎng)基是根據(jù)微生物生長(zhǎng)繁殖時(shí)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要而配制的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，

碳源、氮源、無機(jī)鹽、水、生長(zhǎng)因子一、大腸桿菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基：鑒別培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)基：1、根據(jù)其用途可分為五種：選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基

分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基分離雜交瘤細(xì)胞2、按物理狀態(tài)可分為三種：固體、半固體、液體培養(yǎng)基。

123形成菌落1．液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基

牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化鈉0.5g，蒸餾水100ml，加熱溶解以上成分，冷至40-50℃，調(diào)pH值至7.4~7.6，煮沸3-5分鐘，補(bǔ)足水分，過濾、分裝、高壓滅菌。

2．半固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基在液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基100ml中加瓊脂0.2-0.5g，加熱至100℃使瓊脂熔化，分裝試管，高壓滅菌。取出后直立放置至瓊脂凝固。

3．固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基在液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基100ml中加瓊脂2-3g，加熱至100℃使瓊脂化，分裝于試管和三角燒瓶中，高壓滅菌。取出后趁熱將試管傾斜一定角度放置，瓊脂凝固后即成普通瓊脂斜面；將三角燒瓶中培養(yǎng)基傾注于滅菌平皿內(nèi)，凝固后即成瓊脂平板基礎(chǔ)培養(yǎng)基。市場(chǎng)常見瓊脂條LB固體培養(yǎng)基大腸桿菌菌液（LB液體培養(yǎng)基）3、培養(yǎng)基pH測(cè)定及矯正材料：待測(cè)培養(yǎng)基、pH7.4標(biāo)準(zhǔn)比色管、4孔比色架、0.02％酚紅、氫氧化鈉（0.1mol/L、1mol/L）鹽酸（0.1mol/L、1mol/L）蒸餾水試管（與比色管口徑一致）、刻度吸管（5ml、1ml、0.5ml、0.25ml）、培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細(xì)菌需中性或微堿性培養(yǎng)基蒸餾水pH矯正過酸相同過堿標(biāo)準(zhǔn)比色管待測(cè)管培養(yǎng)基蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)比色管待測(cè)管培養(yǎng)基蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)比色管待測(cè)管分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染；若不慎沾在了管口，可用濕紗布揩凈。5、加塞作用：防止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)造成污染，并保證有良好的通氣性能。棉塞不能用脫脂棉易吸水，容易引起污染A—配制時(shí)紗布塞法B—滅菌時(shí)包牛皮紙C—培養(yǎng)時(shí)紗布翻出6、包扎加塞后，試管通常每7支一起，包上一層牛皮紙或兩層報(bào)紙，用線繩扎緊。三角瓶加塞后也用牛皮紙包扎。以活結(jié)形式扎緊，以便使用時(shí)容易解開。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、配制人或?qū)嶒?yàn)組。二、無菌技術(shù)1、獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵:2、消毒與滅菌(1)消毒：概念：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物。包括芽孢和孢子嗎？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒化學(xué)藥劑消毒:酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外線消毒不包括防止外來雜菌的入侵（2）滅菌概念：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a

灼燒滅菌b干熱滅菌c

高壓蒸汽滅菌a灼燒滅菌微生物的接種工具直接在火焰的充分燃燒層灼燒b干熱滅菌

160－170℃；1－2h能耐高溫的需要保持干燥的物品(玻璃器皿)C高壓蒸汽滅菌

100kPa121℃15-30min通常用于培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基滅菌★基礎(chǔ)培養(yǎng)基：

121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘★含糖培養(yǎng)基：90℃以上滅菌30分鐘★雞蛋、血清培養(yǎng)基：間歇滅菌3天3次★不耐高溫的液體成分：

G6玻璃砂漏斗濾過除菌細(xì)菌檢驗(yàn)的操作需在無菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。無菌室、超凈工作臺(tái)使用前后需進(jìn)行消毒。細(xì)菌檢驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌標(biāo)本的采集無菌試管、燒瓶的使用3.無菌環(huán)境4.接種前準(zhǔn)備用肥皂洗手并使用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈→酒精棉擦拭雙手→酒精棉擦拭桌面三、大腸桿菌的分離消除污染雜菌、篩選高表達(dá)菌株使用哪種培養(yǎng)基？配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄實(shí)驗(yàn)流程倒平板接種、劃線灼燒接種環(huán)→取菌液→劃線分離燒至暗紅接種、劃線灼燒接種環(huán)→取菌液→劃線分離菌液膜接種、劃線1、劃線分離法為什么通過劃線分離可得到單菌落？每劃完一個(gè)區(qū)域要不要灼燒接種環(huán)？①④③②一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。防止培養(yǎng)基蒸發(fā)的水蒸氣凝結(jié)成水滴沖散菌落，影響對(duì)細(xì)菌的觀察(1).為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。(2).在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？(3).在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。2、涂布分離法是指將培養(yǎng)的菌液稀釋一定的倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.370C恒溫培養(yǎng)箱分離后,一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一菌落一個(gè)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過一定時(shí)間的生長(zhǎng)繁殖之后，所形成的肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)①大?、谛螤睥圻吘墷鼙砻姊萋∑鸲娶尥该鞫娶哳伾嗳苎员砻嫔L(zhǎng)

沉淀生長(zhǎng)

混濁生長(zhǎng)