地中海貧血基因檢測

在臨床診斷上的應(yīng)用亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司

地中海貧血地中海貧血，又稱海洋性貧血，是一種常見的單基因遺傳性溶血性血液疾病。廣泛分布在全世界沿海地區(qū)。中國常見于東南沿海、西南地區(qū)以及臺(tái)灣地區(qū)。地中海貧血的分布地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一人類不同時(shí)期血紅蛋白的組成胚胎期血紅蛋白：HbGower1（x2e2）HbGower2(a2

e2)HbPortland(x2

g2)即HbPortland1另有少量HbPortland2(x2

b2)，HbPortland3(x2

d2)胎兒期主要血紅蛋白：HbF（a2g2）成人主要血紅蛋白：HbA（a2

b2）約占血紅蛋白總量96.5—97.5%HbA2（a2

d2）約占血紅蛋白總量2.5—3.5%HbF（a2

g2）約占血紅蛋白總量1%以下。血紅蛋白a2b2za2a1Chromosome16Chromosome11a-globingeneclusterb-globingeneclustereggdbPredominantHaemoglobinEMBRYONICFETALADULTz2e2a2g2(a2d2)Hemoglobin

α-地中海貧血α-地中海貧血（簡稱α-地貧）是一種由于α-珠蛋白基因突變導(dǎo)致肽鏈表達(dá)失衡而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病。多由α-珠蛋白基因的缺失突變所致。研究發(fā)現(xiàn)中國地區(qū)常見的3種α-地貧主要由--SEA、-α3.7、-α4.2缺失(左缺失）引起。-地中海貧血-地中海貧血是一種由于-珠蛋白基因突變導(dǎo)致肽鏈合成減少或缺乏而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病，多由-珠蛋白基因點(diǎn)突變所致。在中國人群中常見的突變位點(diǎn)有CD41-42M，-28M，IVS-II-654M，CD71-72M等中國南方α和β地貧的人群攜帶率地區(qū)攜帶率（％）α地貧β地貧廣州8.532.54廣西14.956.78四川1.922.18貴州-4.72臺(tái)灣4.201.10香港5.023.41a地貧的基因型與表現(xiàn)型Normal(αα/αα)正常α+thaltrait(αα/-α3.7)(αα/-α4.2)

靜止型－單一α基因缺失或喪失功能臨床無任何癥狀，一般血液學(xué)檢查無異樣，僅平均紅細(xì)胞體積(MCV)位于正常值下限。a地貧的基因型與表現(xiàn)型HbHdisease(-α

3.7/--SEA)(-α

4.2/--SEA)αoThaltrait(αα/--SEA)(-α/-α)血紅蛋白H病－3個(gè)α基因缺失或喪失功能肝脾腫大，中度貧血。小細(xì)胞，低色素，HbH含

量較高，易發(fā)生溶血，有些病例需不定期輸血，

癥重者甚至需切除脾臟。標(biāo)準(zhǔn)型－2個(gè)α基因缺失或喪失功能臨床無癥狀，血液學(xué)檢查出現(xiàn)輕微貧血，紅細(xì)胞大小不均一，平均紅細(xì)胞體積(MCV)及平均血紅蛋白含量(MCH)明顯偏低。a地貧的基因型與表現(xiàn)型HbBart'sHydrops(--SEA/--SEA)

HbBart’s水腫胎兒綜合癥－4個(gè)基因缺失或喪失功能患胎于妊娠晚期或產(chǎn)后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡，全身水腫，肝脾腫大。由于胎兒無法合成亞基，臍血血紅蛋白（HbBart’s

，4）含量高。中國南方HbH病基因的主要構(gòu)成省份例數(shù)非缺失型缺失型aaT/--、aaT/aaT-a3.7/---a4.2/---a2.7/--nn%n%n%n%廣西1366044.13525.73928.721.5廣東1362719.97152.23827.9--四川551934.52749.1916.4--江西27829.6829.61140.8--香港38513.22668.4718.4--臺(tái)灣22511450.79441.8177.5--合計(jì)61723337.826142.312119.620.3a地貧疾病嚴(yán)重程度的單倍型順序a2a1T<a2-<-a1<a2Ta1<-a1T<--b地貧的基因型與表現(xiàn)型

中間型-地中海貧血患者臨床癥狀介于重型和輕型之間，如中度偏重貧血，生長發(fā)育遲緩，黃疸等。血液檢查呈小細(xì)胞低色素貧血癥。＋/

＋、＋/

0（純合子或雙重雜合子）中國南方高發(fā)區(qū)的主要突變類型突變類型廣州臺(tái)灣香港廣西四川貴州湖北福建n%n%n%n%n%n%n%n%CD41-4218440.720236.34547.98344.21723.61740.51229.31441.265410022.122840.72021.3126.4912.5716.71741.51338.3-286714.8447.977.43619.268.312.437.312.9CD17419.1386.899.53619.22433.41638.137.3411.8CD71-72153.330.50042.111.40012.400Cd26112.491.611.1-----------29102.210.211.142.179.712.437.312.9CD43920.10.2--31.611.40024.912.9-地中海貧血基因診斷可同時(shí)檢測--SEA、-3.7、-4.2等3種缺失型-地中海貧血?？蓹z出無臨床癥狀的靜止型-地貧（/-3.7、

/-4.2），應(yīng)用：婚前檢查、產(chǎn)前檢查及產(chǎn)前診斷。

-地中海貧血基因診斷操作流程PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)液Mix-A 21μLDNA模板 4μL(200-500ng)Total 25μL96℃ 15min 98℃ 45s64℃ 1min30s 35cycles72℃ 3min72℃ 5min-地中海貧血基因診斷試劑盒：

----采用電泳結(jié)果判讀MDNAMarker1.(/)1.8kb2.(/-

4.2)1.8kb;1.6kb3.(/-

3.7)2.0kb;1.8kb4.(-

4.2/--SEA)1.6kb;1.3kb5.(-

3.7/--SEA)2.0kb;1.3kb6.(/--SEA)1.8kb;1.3kbM123456M-珠蛋白基因型 PCR產(chǎn)物片段長度

-

3.7 2.0kb

1.8kb-

4.2 1.6kb--SEA 1.3kb注：β-地中海貧血基因診斷可對17個(gè)突變位點(diǎn)(8個(gè)常見位點(diǎn)及9個(gè)少見位點(diǎn))進(jìn)行檢測合理的探針設(shè)計(jì)明顯減少了非特異性雜交反應(yīng)的發(fā)生。位點(diǎn)設(shè)計(jì)更合理，絕大部分突變位點(diǎn)都有相應(yīng)正常對照，結(jié)果易于判定β-地貧基因診斷；攜帶者檢出

β-地中海貧血基因診斷操作流程PCR擴(kuò)增用生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增待測樣品DNA PCR-Mix-I 23μL DNA模板 2μL Total 25μL50℃ 15min95℃ 10min 94℃ 1min50℃ 30s35cycles72℃ 30s72℃ 5min取15mL塑料離心管，放入膜條，加入A液5-6mL及PCR產(chǎn)物。將塑料管放入沸水中加熱10分鐘，取出擰緊蓋子，放入42℃雜交箱雜交1.5—4小時(shí)。

變性及雜交洗膜取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50mL管中，于42℃輕搖洗滌15分鐘

顯色1）POD溶液孵育30分鐘2）洗滌用A液室溫洗兩次，每次5分鐘。3）顯色將膜條浸泡于顯色液中避光顯色10-15分鐘即可見斑點(diǎn)顯現(xiàn)。N/N654M/N41-42M/N結(jié)果判讀41-42N654N－28N71-72N17NβEN31N27/28M41-42M654M－28M71-72M17MβEM31MIVS1-1M43M－32M－29M－30M14-15MCAP