醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)12/11/20221第一章蛋白質(zhì)的分離與純化第一節(jié)蛋白質(zhì)分離純化的一般原則一、蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)及其依據(jù)表1－1主要的蛋白質(zhì)分離純化方法及依據(jù)

性質(zhì)分離方法分子大小與形狀超濾、透析、密度梯度離心、凝膠過濾層析、凝膠電泳溶解度沉淀法、相分配法、分配層析、結(jié)晶、溶劑抽提、逆流分配電荷分布電泳技術(shù)、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析、聚焦層析、等電聚倍數(shù)電泳生物功能專一性親和層析疏水性疏水作用層析、反相高效液相層析12/11/20222第一章蛋白質(zhì)的分離與純化二、蛋白質(zhì)純化的一般設(shè)計(jì)原則1、目的蛋白的分離和純化應(yīng)該盡可能選擇來(lái)源方便、成本低、易操作的組織或細(xì)胞作為原料；2、要建立一個(gè)特異、快速、可重復(fù)、經(jīng)濟(jì)的目的蛋白活性檢測(cè)方法；3、蛋白質(zhì)分離純化工藝的設(shè)計(jì)應(yīng)該分級(jí)分離、先粗后細(xì)的原則；4、純化條件要盡可能溫和。12/11/20223第一章蛋白質(zhì)的分離與純化第二節(jié)蛋白質(zhì)的層析(chromatography)分離一、層析技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史及科學(xué)意義二、層析技術(shù)的基本原理固定相：在層析系統(tǒng)分離過程中靜止不動(dòng)的相。流動(dòng)相：在層析系統(tǒng)分離過程中在載體上延一定方向移動(dòng)的相。12/11/2022412/11/2022512/11/20226塔板理論：K＝＝(溶質(zhì)在固定相中的濃度)Cs(溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度)Cm把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來(lái)描述組分在兩相間的分配行為，同時(shí)引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡(jiǎn)稱板高。

12/11/20227塔板理論假設(shè)：1.在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板高度H。2.以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（ΔVm）。3.所有組分開始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。4.分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。12/11/20228

簡(jiǎn)單地認(rèn)為：在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方式向前移動(dòng)。對(duì)于一根長(zhǎng)為L(zhǎng)的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：n=L/H

n稱為理論塔板數(shù)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。12/11/2022912/11/20221012/6/20221112/6/202212洗脫法法也稱稱沖洗洗法。。工作作時(shí)，，首先先將樣樣品加加到色色譜柱柱頭上上，然然后用用吸附附或溶溶解能能力比比試樣樣組分分弱得得多的的氣體體或液液體作作沖洗洗劑。。由于于各組組分在在固定定相上上的吸吸附或或溶解解能力力不同同，被被沖洗洗劑帶帶出的的先后后次序序也不不同，，從而而使組組分彼彼此分分離。。流出出曲線線下圖圖。層析的的展開開方式式12/6/202213頂替法法是將將樣品品加到到色譜譜柱頭頭后，，在惰惰性流流動(dòng)相相中加加入對(duì)對(duì)固定定相的的吸附附或溶溶解能能力比比所有有試樣樣組分分強(qiáng)的的物質(zhì)質(zhì)為頂頂替劑劑（或或直接接用頂頂替劑劑作流流動(dòng)相相），，通過過色譜譜柱，，將各各組分分按吸吸附或或溶解解能力力的強(qiáng)強(qiáng)弱順順序，，依次次頂替替出固固定相相。很很明顯顯，吸吸附或或溶解解能力力最弱弱的組組分最最先流流出，，最強(qiáng)強(qiáng)的最最后流流出。。頂替替法的的流出出曲線線如下下圖。。12/6/20221412/6/202215迎頭法是將試試樣混合物連連續(xù)通過色譜譜柱，吸附或或溶解能力最最弱的組分首首先一純物質(zhì)質(zhì)的狀態(tài)流出出，其次則以以第一組分和和吸附或溶解解能力較弱的的第二組分混混合物，以此此類推。流出出曲線如下圖圖。A+BA12/6/202216層析流出曲線線及相關(guān)術(shù)語(yǔ)語(yǔ)色譜流出曲線線和色譜峰由檢測(cè)器輸出出的電信號(hào)強(qiáng)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作作圖，所得曲曲線稱為色譜譜流出曲線。。曲線上突起起部分就是色色譜峰。如果進(jìn)樣量很很小，濃度很很低，在吸附附等溫線（氣氣固吸附色譜譜）或分配等等溫線（氣液液分配色譜））的線性范圍圍內(nèi)，則色譜譜峰是對(duì)稱的的。12/6/202217基線線在實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)操操作作條條件件下下，，色色譜譜柱柱后后沒沒有有樣樣品品組組分分流流出出時(shí)時(shí)的的流流出出曲曲線線稱稱為為基基線線，，穩(wěn)穩(wěn)定定的的基基線線應(yīng)應(yīng)該該是是一一條條水水平平直直線線。。峰高高色譜譜峰峰頂頂點(diǎn)點(diǎn)與與基基線線之之間間的的垂垂直直距距離離，，以以（（h））表表示示。。12/6/202218色譜譜流流出出曲曲線線色譜譜流流出出曲曲線線和和色色譜譜峰峰基線線（（a））峰高高（（h））信號(hào)進(jìn)樣空氣峰色譜峰ha12/6/202219保留值值死時(shí)間間t0不被固固定相相吸附附或溶溶解的的物質(zhì)質(zhì)進(jìn)入入色譜譜柱時(shí)時(shí)，從從進(jìn)樣樣到出出現(xiàn)峰峰極大大值所所需的的時(shí)間間稱為為死時(shí)時(shí)間，，它正正比于于色譜譜柱的的空隙隙體積積，如如下圖圖。信號(hào)進(jìn)樣t0因?yàn)檫@這種物物質(zhì)不不被固固定相相吸附附或溶溶解，，故其其流動(dòng)動(dòng)速度度將與與流動(dòng)動(dòng)相流流動(dòng)速速度相相近。。測(cè)定定流動(dòng)動(dòng)相平平均線線速ūū時(shí)，，可用用柱長(zhǎng)長(zhǎng)L與與t0的比比值計(jì)計(jì)算，，即ū=L/t012/6/202220信號(hào)進(jìn)樣tr2.保留時(shí)間tr試樣從進(jìn)樣樣到柱后出出現(xiàn)峰極大大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)經(jīng)過的時(shí)間間，稱為保保留時(shí)間，，如下圖。。12/6/2022213.調(diào)整保留時(shí)時(shí)間tr′某組分的保保留時(shí)間扣扣除死時(shí)間間后，稱為為該組分的的調(diào)整保留留時(shí)間，即即tr′=trt0由于組分在在色譜柱中中的保留時(shí)時(shí)間tr包含了組分分隨流動(dòng)相相通過柱子子所須的時(shí)時(shí)間和組分分在固定相相中滯留所所須的時(shí)間間，所以tr實(shí)際上是組組分在固定定相中保留留的總時(shí)間間。保留時(shí)間是是色譜法定定性的基本本依據(jù)，但但同一組分分的保留時(shí)時(shí)間常受到到流動(dòng)相流流速的影響響，因此色色譜工作者者有時(shí)用保保留體積來(lái)來(lái)表示保留留值。12/6/2022224.死體積V0指色譜柱在在填充后，，柱管內(nèi)固固定相顆粒粒間所剩留留的空間、、色譜儀中中管路和連連接頭間的的空間以及及檢測(cè)器的的空間的總總和。當(dāng)后后兩相很小小可忽略不不計(jì)時(shí)，死死體積可由由死時(shí)間與與色譜柱出出口的載氣氣流速Fco（cm3·min-1）計(jì)算。V0=t0Fco式中Fco為扣除飽和和水蒸氣壓壓并經(jīng)溫度度校正的流流速。僅適用于氣氣相色譜，，不適用于于液相色譜譜。12/6/2022235.保留體積Vr指從進(jìn)樣開開始到被測(cè)測(cè)組分在柱柱后出現(xiàn)濃濃度極大點(diǎn)點(diǎn)時(shí)所通過過的流動(dòng)相相的體積。。保留時(shí)間間與保留體體積關(guān)系：：Vr=trFco6.調(diào)整保留體體積Vr某組分的保保留體積扣扣除死體積積后，稱為為該組分的的調(diào)整保留留體積。Vr=VrV0=trFco12/6/2022247.相對(duì)保留留值r2,1某組分2的調(diào)整整保留值值與組分分1的調(diào)調(diào)整保留留值之比比，稱為為相對(duì)保保留值。。r2,1=tr2/tr1′=Vr2/Vr1由于相對(duì)對(duì)保留值值只與柱柱溫及固固定相性性質(zhì)有關(guān)關(guān)，而與與柱徑、、柱長(zhǎng)、、填充情情況及流流動(dòng)相流流速無(wú)關(guān)關(guān)，因此此，它在在色譜法法中，特特別是在在氣相色色譜法中中，廣泛泛用作定定性的依依據(jù)。12/6/202225在定性分析中中，通常固定定一個(gè)色譜峰峰作為標(biāo)準(zhǔn)（（s），然后后再求其它峰峰（i）對(duì)這這個(gè)峰的相對(duì)對(duì)保留值，此此時(shí)可用符號(hào)號(hào)表示，即=tr(i)/tr(s)式中tr(i)為后出峰的調(diào)調(diào)整保留時(shí)間間，所以總是大于1的的。相對(duì)保留留值往往可作作為衡量固定定相選擇性的的指標(biāo)，又稱稱選擇因子。。區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)區(qū)域?qū)挾仁鞘巧V流出出曲線的重重要參數(shù)之之一，用于于衡量柱效效率及反映映色譜操作作條件的動(dòng)動(dòng)力學(xué)因素素。表示色色譜峰區(qū)域域?qū)挾韧ǔ３Ｓ腥N方方法。12/6/2022261.標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏偏差差即0.607倍倍峰峰高高處處色色譜譜峰峰寬寬的的一一半半。。2.半半峰峰寬寬W1/2即峰峰高高一一半半處處對(duì)對(duì)應(yīng)應(yīng)的的峰峰寬寬。。它它與與標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏偏差差的的關(guān)關(guān)系系為為W1/2=2.3543.峰峰底底寬寬度度W即色色譜譜峰峰兩兩側(cè)側(cè)拐拐點(diǎn)點(diǎn)上上的的切切線線在在基基線線上上截截距距間間的的距距離離。。它它與與標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏偏差差的關(guān)關(guān)系系是是W=412/6/20222712/6/202228從色譜流流出曲線線中，可可得許多多重要信信息：(i)根根據(jù)色色譜峰的的個(gè)數(shù)，，可以判判斷樣品品中所含含組分的的最少個(gè)個(gè)數(shù)；(ii)根據(jù)據(jù)色譜峰峰的保留留值，可可以進(jìn)行行定性分分析；(iii)根根據(jù)色譜譜峰的面面積或峰峰高，可可以進(jìn)行行定量分分析；(iv)色譜譜峰的保保留值及及其區(qū)域域?qū)挾?，，是評(píng)價(jià)價(jià)色譜柱柱分離效效能的依依據(jù)；(v)色色譜峰峰兩峰間間的距離離，是評(píng)評(píng)價(jià)固定定相（或或流動(dòng)相相）選擇擇是否合合適的依依據(jù)。12/6/202229三、離子子交換層層析離子交換換層析(ionexchangechromatography)利用用物質(zhì)的的電荷與與層析載載體(離離子交換換劑)電電荷之間間的相互互作用達(dá)達(dá)到分離離純化的的目的的的層析方方法稱離離子交換換層析。。離子交換換劑：離離子交換換層析所所用的固固相基質(zhì)質(zhì)，由不不溶于水水的、具具有網(wǎng)狀狀結(jié)構(gòu)的的高分子子聚合物物組成。。12/6/20223012/6/202231離子交換換層析的的操作1、樣品品的準(zhǔn)備備：固體體樣品必必須溶于于適當(dāng)離離子強(qiáng)度度和pH的緩沖沖液中。。組織液液或細(xì)胞胞裂解液液用緩沖沖液稀釋釋后可直直接上柱柱。鹽析析樣品必必須除鹽鹽后才能能進(jìn)行分分離。2、離子子交換劑劑的處理理：根據(jù)據(jù)被分離離樣品的的性質(zhì)選選擇合適適的離子子交換劑劑，離子子交換劑劑在使用用前須先先進(jìn)行處處理。12/6/2022323、層層析柱柱的準(zhǔn)準(zhǔn)備：：離子子交換換層析析柱一一般選選擇粗粗短柱柱為宜宜，使使得樣樣品在在分離離的同同時(shí)進(jìn)進(jìn)行濃濃縮。。離子子交換換劑的的用量量根據(jù)據(jù)樣品品量和和交換換劑的的交換換容量量確定定。4、樣樣品分分離：：上樣樣量的的多少少與目目的蛋蛋白的的性質(zhì)質(zhì)、濃濃度及及交換換劑的的親和和力有有關(guān)。。在分分離過過程中中，應(yīng)應(yīng)注意意12/6/2022331）樣樣品的的濃度度不宜宜過大大2）溶溶解蛋蛋白質(zhì)質(zhì)樣品品的緩緩沖液液的離離子強(qiáng)強(qiáng)度要要低于于起始始緩沖沖液3）上上樣速速度不不要過過快4）上上樣緩緩沖液液的pH應(yīng)應(yīng)合適適5、洗洗脫12/6/2022346、洗洗脫液液的鑒鑒定和和回收收7、離離子交交換劑劑的再再生與與儲(chǔ)存存12/6/20223512/6/202236兔γγ－－球球蛋蛋白白的的木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶水水解解物物在在CM纖纖維維素素柱柱上上的的層層析析分分離離12/6/202237天花粉各成分分用特種離子子交換劑層析析分離12/6/20223812/6/20223912/6/202240二、分分子篩篩原理理12/6/20224112/6/20224212/6/202243凝膠膠過過濾濾的的分分配配系系數(shù)數(shù)K=(Ve-V0)(Vi)12/6/202244主要凝膠膠過濾介介質(zhì)的牌牌號(hào)及骨骨架結(jié)構(gòu)構(gòu)12/6/202245葡聚糖凝凝膠(G)型號(hào)分離范圍(分子量)吸水量(克／克干凝膠)膨脹體積(毫升／克干凝膠)浸泡時(shí)間蛋白質(zhì)多糖20～25℃90~100℃10<700<7001.02-33115<1500<15001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-4072512/6/202246親和層析析：利用用生物分分子間特特殊的親親和關(guān)系系進(jìn)行的的分離方方法。是是蛋白質(zhì)質(zhì)分離純純化的最最有效的的方法之之一，有有時(shí)甚至至可以僅僅用一步步純化即即可達(dá)到到純化目目的。只只要被分分離蛋白白、配基基和載體體之間能能形成以以下的關(guān)關(guān)系，即即可進(jìn)行行親和層層析12/6/20224712/6/202248基本原理：：親和層析析法利用了了生命現(xiàn)象象中生物分分子之間非非常特異的的相互作用用而進(jìn)行分分離純化的的方法。生生物體內(nèi)能能發(fā)生特異異的相互作作用的成分分有：酶與酶的底底物酶與酶的抑抑制劑酶與酶的變變構(gòu)效應(yīng)劑劑酶與酶的輔輔酶激素與細(xì)胞胞膜上的受受體維生素與結(jié)結(jié)合蛋白核酸抗原與抗體體外源凝集素素與紅細(xì)胞胞表面的抗抗原12/6/202249特異性強(qiáng)分辨率高回收率高層析柱的再生方便親和層析特點(diǎn)特別適用于微量生物活性物質(zhì)的分離12/6/202250電泳是指帶電粒粒子在電場(chǎng)場(chǎng)中向與其其自身帶相相反電荷的的電極移動(dòng)動(dòng)的現(xiàn)象正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子蛋白質(zhì)的電電泳分離12/6/202251++++++++--------++++++++--------蛋白質(zhì)膠體體顆粒的沉沉淀帶正電荷的的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的的蛋白質(zhì)酸酸堿堿脫水脫水脫水不穩(wěn)定的蛋蛋白質(zhì)顆粒粒（沉淀）帶正電荷的的蛋白質(zhì)（疏水膠體體）帶負(fù)電荷的的蛋白質(zhì)（疏水膠體體）堿酸（親水膠體體）（親水膠體體）（親水膠體體）12/6/202252帶電顆粒在在電場(chǎng)中所所受到的電電場(chǎng)力F=EQ根據(jù)Stoke定律律，球形分分子在液體體中泳動(dòng)所所受到的阻阻力F’=6ππrηv電泳原理：：12/6/202253F=F’即：EQ=6πrηv時(shí)，V=EQ6πrη當(dāng)物質(zhì)在電電場(chǎng)中移動(dòng)動(dòng)時(shí)，受到到電場(chǎng)力和和液體阻力力兩方面的的力的影響響，當(dāng)電場(chǎng)場(chǎng)力和阻力力平衡時(shí)，，帶電顆粒粒作勻速運(yùn)運(yùn)動(dòng)，12/6/202254兩個(gè)個(gè)帶帶電電顆顆粒粒能能否否分分開開，，由由兩兩個(gè)個(gè)顆顆粒粒在在電電泳泳過過程程中中的的遷遷移移率率所所決決定定，，即即U=dlVt或d=UVtldU==VEtVl=dlVt或d1-d2=(U1-U2)VtlΔd=12/6/202255遷移移率率（（或或泳泳動(dòng)動(dòng)度度））是指指帶帶電電顆顆粒粒在在單單位位電電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)強(qiáng)度度下下泳泳動(dòng)動(dòng)的的速速度度，，可可用用下下列列公公式式計(jì)計(jì)算算：：Ｕ=υυ/E=(d/t)/(V/l)=dl/VtＵ為遷遷移移率率（（cm2·V-1·min-1）；；υυ為為顆顆粒粒泳泳動(dòng)動(dòng)速速度度（（cm··s-1）；；E為電電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)強(qiáng)度度（（V··cm-1）；；d為顆顆粒粒泳泳動(dòng)動(dòng)的的距距離離（（cm））；；l為濾濾紙紙有有效效長(zhǎng)長(zhǎng)度度（（cm））；；V為實(shí)實(shí)際際電電壓壓（（V））；；t為通通電電時(shí)時(shí)間間（（s或或min））。。通通過過測(cè)測(cè)量量d,l,V,t,即即可可計(jì)計(jì)算算出出被被分分離離物物質(zhì)質(zhì)的的遷遷移移率率。。12/6/202256影響響電電泳泳的的因因素素1、、帶帶電電粒粒子子的的性性質(zhì)質(zhì)與與電電泳泳行行為為2、、電電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)強(qiáng)度度對(duì)對(duì)帶帶電電粒粒子子遷遷移移的的影影響響：：電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)強(qiáng)度度也也稱稱電電位位梯梯度度，，是是指指單單位位長(zhǎng)長(zhǎng)度度（（每每一一厘厘米米））支支持持物物體體上上的的電電位位降降，，它它對(duì)對(duì)泳泳動(dòng)動(dòng)速速度度起起著著十十分分重重要要的的作作用用。。一一般般，，電電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)強(qiáng)度度越越高高，，帶帶電電顆顆粒粒移移動(dòng)動(dòng)速速度度越越快快。。12/6/2022573、溶溶液的的pH對(duì)帶帶電粒粒子遷遷移的的影響響：溶溶液的的pH值決決定了了帶電電顆粒粒解離離的程程度，，也決決定了了物質(zhì)質(zhì)所帶帶凈電電荷的的多少少。4、電電滲對(duì)對(duì)電泳泳的影影響：：電滲滲是在在電場(chǎng)場(chǎng)中液液體對(duì)對(duì)固體體的相相對(duì)移移動(dòng)。。12/6/202258電滲滲作作用用12/6/2022595、離子強(qiáng)強(qiáng)度對(duì)電泳泳的影響：：電泳液中中的離子增增加會(huì)使電電泳遷移率率降低，原原因是帶電電的離子會(huì)會(huì)吸引相反反符號(hào)的離離子聚集在在其周圍，，形成一個(gè)個(gè)與運(yùn)動(dòng)粒粒子符號(hào)相相反的離子子氛，它使使該離子向向相反的方方向運(yùn)動(dòng)，，從而降低低了該粒子子的遷移率率。12/6/2022606、溫度對(duì)對(duì)的電泳的的影響：電泳過程中中由于通電電產(chǎn)生焦耳耳熱，熱對(duì)對(duì)電泳有很很大的影響響。溫度每升高高1℃，遷遷移率約增增加2.4%。為降降低熱效應(yīng)應(yīng)對(duì)電泳的的影響，可可控制電壓壓或電流，，或在電泳泳系統(tǒng)中安安裝冷卻散散熱裝置。。12/6/202261電泳的的分類類和特特點(diǎn)電泳的分類類自由移動(dòng)界界面電泳區(qū)帶電泳穩(wěn)態(tài)電泳12/6/202262自由移動(dòng)界界面電泳（（movingboundaryelectrophoresis）），沒有支支持物，在在一個(gè)U形形管中進(jìn)行行電泳，目目前已被區(qū)區(qū)帶電泳所所取代。區(qū)帶電泳（（zoneelectrophoresis）在一定定的支持物物上進(jìn)行的的電泳，電電泳結(jié)果形形成一條條條的區(qū)帶而而得名。穩(wěn)態(tài)電泳（（steadystateelectrophoresis）帶電顆顆粒電泳一一定時(shí)間后后達(dá)到穩(wěn)態(tài)態(tài)而停止移移動(dòng)。12/6/20226312/6/202264聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝膠膠電電泳泳（（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE））聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝膠膠是是由由單單體體丙丙烯烯酰酰胺胺Acr和和交交聯(lián)聯(lián)劑劑N,N’’-甲甲叉叉雙雙丙丙烯烯酰酰胺胺Bis聚聚合合而而成成12/6/20226512/6/202266聚合過程需要要有催化劑參參加，有兩種種聚合方式，，化學(xué)聚合和和光聚合。催催化劑包括引引發(fā)劑和加速速劑兩部分組組成。化學(xué)聚聚合反應(yīng)的引引發(fā)劑常為過過硫酸銨，過過硫酸銨首先先形成自由基基，通過自由由基傳遞，使使丙烯酰胺成成為自由基，，發(fā)動(dòng)聚合反反應(yīng)。加速劑劑四甲基乙乙二胺（tetramethylethylenediamine，，TEMED）可加快引引發(fā)劑釋放自自由基的速度度；光學(xué)聚合合反應(yīng)的引發(fā)發(fā)劑為核黃素素。12/6/202267聚丙烯凝凝膠的特特點(diǎn)①在一定定濃度時(shí)時(shí)，凝膠膠透明，，有彈性性，機(jī)械械性能好好；②化學(xué)性性能穩(wěn)定定，與被被分離物物不發(fā)生生化學(xué)反反應(yīng)；③對(duì)pH和溫度度變化較較穩(wěn)定；；④幾乎無(wú)無(wú)電滲作作用，只只要Acr純度度高，操操作條件件一致，，則樣品品分離重重復(fù)性極極好。⑤樣品不不易擴(kuò)散散，且用用量少，，其靈敏敏度可達(dá)達(dá)10-6g。⑥凝膠孔孔徑可通通過選擇擇單體及及交聯(lián)劑劑的濃度度調(diào)節(jié)。。⑦分辯率率高，尤尤其在不不邊疆凝凝膠電泳泳中，集集濃縮、、分子篩篩和電荷荷效應(yīng)為為一體。。12/6/202268凝膠孔徑徑及其有有關(guān)性質(zhì)質(zhì)①凝膠性性能與總總濃度及及交聯(lián)度度的關(guān)系系凝凝膠的孔孔徑、機(jī)機(jī)械性能能、彈性性、透明明度、黏黏度和聚聚合程度度取決于于凝膠總總濃度和和Acr與Bis之比比。T（Acr和Bis總濃度）%=×100%a+bmc（交聯(lián)劑百分比）%=×100%ba+b12/6/202269a/b與凝膠膠的機(jī)械性能能密切相關(guān)。。當(dāng)（a/b）<10時(shí)，凝膠膠脆而易碎，，堅(jiān)硬呈乳白白色；（a/b））>100時(shí)時(shí)，即使5%的凝膠也呈呈糊狀，易于于斷裂。欲制制備完全透明明而又有彈性性的凝膠，應(yīng)應(yīng)控制（a/b）=30左右。。T一般為5%~10%。②凝膠濃度與與孔徑的關(guān)系系T與c不僅與凝膠的的機(jī)械性能有有關(guān)，還與凝凝膠的孔徑關(guān)關(guān)系極為密切切。一般講，，T越大，孔孔徑越小。此此外，孔徑還還同Bis與與Acr的比比例有關(guān)，Bis占Acr總濃度度5%時(shí)，孔孔徑最小。③凝膠濃度與與被分離物相相對(duì)分子質(zhì)量量有關(guān)。12/6/20227012/6/202271聚丙烯酰胺凝凝膠電泳垂直平板電泳泳水平板電泳圓盤電泳連續(xù)電泳不連續(xù)電泳Disc電泳泳12/6/202272丙烯酰胺凝膠膠電泳的應(yīng)用用聚丙烯酰胺凝凝膠電泳根據(jù)據(jù)其有無(wú)濃縮縮效應(yīng)，可分分為連續(xù)的和和不連續(xù)的兩兩類。前者指整個(gè)電電泳系統(tǒng)中所所用緩沖液，，pH值和凝膠網(wǎng)孔孔都是相同的的；后者是指指在電泳系統(tǒng)統(tǒng)中采用了兩兩種或兩種以以上的緩沖液液、pH值和孔徑，不不連續(xù)電泳能能使稀的樣品品在電泳過程程中濃縮成層層，從而提高高分辨能力。。12/6/202273在不不連連續(xù)續(xù)PAGE系統(tǒng)統(tǒng)里里，，存存在在三三種種物物理理效效應(yīng)應(yīng),，即即電電荷荷效效應(yīng)應(yīng)、、分分子子篩篩效效應(yīng)應(yīng)和和濃濃縮縮效效應(yīng)應(yīng)。。１、、電電荷荷效效應(yīng)應(yīng)：：各各種種蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)按按其其所所帶帶電電荷荷的的種種類類及及數(shù)數(shù)量量，，在在電電場(chǎng)場(chǎng)向向一一定定電電極極，，以以一一定定速速度度泳泳動(dòng)動(dòng)。。２、、分分子子篩篩效效應(yīng)應(yīng)：：區(qū)別別不不同同大大小小分分子子種種類類的的能能力力是是凝凝膠膠所所具具有有的的一一種種篩篩分分大大小小的的能能力力即即分分子子篩篩效效應(yīng)應(yīng)。。這種種效效應(yīng)應(yīng)與與凝凝膠膠過過濾濾過過程程中中的的情情況況不不同同。。12/6/202274濃縮效效應(yīng)12/6/20227512/6/20227612/6/20227712/6/202278§9蛋白質(zhì)質(zhì)的研究歷史史與方法SDS－PAGE電泳是應(yīng)用聚聚丙烯凝膠電電泳測(cè)定蛋白白質(zhì)分子量的的一種有效的的方法。SDS是陰離子子變性劑，使使蛋白質(zhì)分子子變性為直鏈鏈狀，且其所所帶陰離子將將蛋白質(zhì)分子子所帶電荷完完全履蓋，具具有相似的荷荷質(zhì)比，電泳泳過程完全與與蛋白質(zhì)的分分子量相關(guān)。。電泳結(jié)束后后的凝膠用考考馬斯亮蘭或或銀染后與已已知分子量的的蛋白質(zhì)的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較較得出。12/6/20227912/6/202280§9蛋白質(zhì)質(zhì)的研究歷史史與方法二維電泳是等等電聚焦電泳泳與SDS－－PAGE電電泳結(jié)合的雙雙向電泳。電電泳過程用柱柱狀等電聚焦焦電泳后再行行SDS－PAGE電泳泳，等電聚焦焦電泳利用蛋蛋白質(zhì)等電點(diǎn)點(diǎn)進(jìn)行分離，，SDS－PAGE根據(jù)據(jù)蛋白質(zhì)分子子量實(shí)現(xiàn)分離離。因?yàn)榈入婋婞c(diǎn)相同而分分子量也相同同的蛋白質(zhì)幾幾乎是不存在在的，所以二二維電泳可將將所有蛋白質(zhì)質(zhì)分子分開。。12/6/20228112/6/20228212/6/20228312/6/202284等電點(diǎn)聚焦焦（isoelectricfocusing）原理:在一定抗對(duì)對(duì)流介質(zhì)（（如凝膠））中加入兩兩性電解質(zhì)質(zhì)載體(Ampholyte,是一種種多氨基多多羧基的混混合物，由由異構(gòu)物和和同系物組組