11分子熒光分析法11分子熒光分析法基本要求掌握分子熒光的發(fā)生過(guò)程，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，熒光光譜的特征，分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系；影響熒光強(qiáng)度的因素，熒光定量分析方法。熟悉分子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的各種途徑，熒光壽命與熒光效率。了解熒光分光光度計(jì)與其他熒光分析技術(shù)。2基本要求掌握分子熒光的發(fā)生過(guò)程，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，熒光光譜最新11分子熒光分析法課件最新11分子熒光分析法課件最新11分子熒光分析法課件最新11分子熒光分析法課件最新11分子熒光分析法課件最新11分子熒光分析法課件一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1、分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程分子的多重性M:M=2s+1，s表示總自旋量子數(shù)，s=0時(shí)分子所處的電子能態(tài)為單重態(tài)，用S來(lái)表示；s=1時(shí)分子所處的電子能態(tài)為三重態(tài)，用T來(lái)表示；9一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1、分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程光吸收過(guò)程失活過(guò)程發(fā)光失活分子間能量轉(zhuǎn)移失活非輻射失活熒光磷光振動(dòng)馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間跨躍2.熒光的產(chǎn)生10光吸收過(guò)程失活過(guò)程發(fā)光失活分子間能量轉(zhuǎn)移失活非輻射失活熒光磷吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳豫外轉(zhuǎn)換基態(tài)熒光壽命:10－9～10－7s磷光壽命:10－4～10s圖11-2熒光和磷光產(chǎn)生示意圖11吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳輻射躍遷－發(fā)光失活熒光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)單線(xiàn)態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。磷光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)三重態(tài)T1的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。波長(zhǎng)關(guān)系：激發(fā)光＜熒光＜磷光。12輻射躍遷－發(fā)光失活12無(wú)輻射失活a.振動(dòng)弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級(jí)中的較高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程，其效率較高b.內(nèi)轉(zhuǎn)換：當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非常接近以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，電子由高能級(jí)回到低能級(jí)的過(guò)程。13無(wú)輻射失活13無(wú)輻射失活c.外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑、溶質(zhì)分子之間發(fā)生相互碰撞而失去能量的過(guò)程。d.系間跨越：激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過(guò)程。14無(wú)輻射失活14吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳豫外轉(zhuǎn)換基態(tài)熒光壽命:10－9～10－7s磷光壽命:10－4～10s圖11-2熒光和磷光產(chǎn)生示意圖15吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳結(jié)論：熒光是來(lái)自最低激發(fā)單重態(tài)的輻射躍遷過(guò)程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光過(guò)程的速率常數(shù)大，激發(fā)壽命短；磷光是來(lái)自最低激發(fā)三重態(tài)的輻射躍遷過(guò)程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光過(guò)程的速率常數(shù)小，激發(fā)壽命相對(duì)比較長(zhǎng)。16結(jié)論：熒光是來(lái)自最低激發(fā)單重態(tài)的輻射躍遷過(guò)程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象復(fù)習(xí)：熒光的產(chǎn)生基態(tài)分子hv激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，如何回去？17復(fù)習(xí)：基態(tài)分子hv激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，如何回去？17S2S0S1T1l2l1分子的吸收情況18S2S0S1T1l2l1分子的吸收情況18S2S0S1T1l2l1振動(dòng)弛豫：在同一電子能級(jí)（激發(fā)態(tài)）…特點(diǎn)：無(wú)輻射；速率快（10-14～10-12s內(nèi)完成）19S2S0S1T1l2l1振動(dòng)弛豫：在同一電子能級(jí)（激發(fā)態(tài)）…S2S0S1T1l2l1內(nèi)轉(zhuǎn)移（internalconversion)：相同多重性的兩個(gè)電子能級(jí)之間的非輻射躍遷20S2S0S1T1l2l1內(nèi)轉(zhuǎn)移（internalconveS2S0S1T1l2l1l3熒光發(fā)射Fluorescence21S2S0S1T1l2l1l3熒光發(fā)射Fluorescencel1l2l3l3>l1>l2Onlyl322l1l2l3l3>l1>l222S2S0S1T1l2l1系間跨躍磷光發(fā)射l4IntersystemCrossingPhosphorescence23S2S0S1T1l2l1系間跨躍磷光發(fā)射l4IntersysS0S1T1l2l1外轉(zhuǎn)移

ExternalConversion24S0S1T1l2l1外轉(zhuǎn)移ExternalConvers復(fù)習(xí)分子熒光的發(fā)生過(guò)程基態(tài)分子概念：基態(tài)、激發(fā)態(tài)（激發(fā)單重態(tài)S*、激發(fā)三重態(tài)T*）能量傳遞過(guò)程：1、無(wú)輻射躍遷（振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換、外轉(zhuǎn)換、系間跨越）2、輻射躍遷（熒光、磷光）25復(fù)習(xí)分子熒光的發(fā)生過(guò)程25吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳豫外轉(zhuǎn)換基態(tài)熒光壽命:10－9～10－7s磷光壽命:10－4～10s圖11-2熒光和磷光產(chǎn)生示意圖26吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光物質(zhì)分子都具有兩個(gè)特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）。激發(fā)光譜：不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)熒光的相對(duì)效率。熒光光譜：在所發(fā)射的熒光中各種波長(zhǎng)組分的相對(duì)強(qiáng)度。圖11-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜27（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光物質(zhì)分子都具有兩個(gè)特征光譜激發(fā)光譜和發(fā)射光譜具有三個(gè)特點(diǎn)：⑴斯托克斯位移，波長(zhǎng)：熒光＞激發(fā)光；⑵熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)；⑶熒光光譜和激發(fā)光譜大致成鏡像關(guān)系。圖11-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜28激發(fā)光譜和發(fā)射光譜具有三個(gè)特點(diǎn)：圖11-3蒽的激發(fā)光譜和蒽的激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光光譜)激發(fā)光譜:ExcitationSpectrum,激發(fā)波長(zhǎng):ex發(fā)射光譜EmissionSpectrum,發(fā)射波長(zhǎng):em圖11-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜b0b1b2b3c3c2c1c029蒽的激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光光譜)激發(fā)光譜:Ex二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率熒光壽命(τf)：

除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到激發(fā)時(shí)最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間稱(chēng)為熒光壽命(10-8～10-10s)。熒光物質(zhì)受到一個(gè)極短時(shí)間的脈沖光激發(fā)后，熒光強(qiáng)度從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的變化，可用指數(shù)衰減定律表示

Ft=F0e-Kt，推導(dǎo)得lnF0/Ft=t/τf

F0、Ft

：開(kāi)始時(shí)和t時(shí)的熒光強(qiáng)度，

K為衰減常數(shù)。30二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率熒光壽命(τf)：熒光效率(f)：又稱(chēng)為熒光量子產(chǎn)率或熒光產(chǎn)率。3131（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1.共軛效應(yīng)

→*躍遷芳香族化合物、五元雜環(huán)上取代苯基.

共軛體系越大,越易產(chǎn)生熒光,熒光效率也增大.─(CH=CH)3─

φ=0.68─(CH=CH)2─φ=0.2832（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1.共軛效應(yīng)→2.剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)酚酞(無(wú)熒光)8－羥基喹啉(弱熒光)紅色熒光CO-OOCOO-COCOO--ONO-NOMgNO熒光黃332.剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)酚酞(無(wú)熒光)8－羥基喹啉(弱熒光聯(lián)二苯φ=0.2芴φ=1.03,4-苯并芘(強(qiáng)熒光物質(zhì))CH234聯(lián)二苯φ=0.2芴φ=1.03,4-苯并芘(強(qiáng)Ff＝0.75Ff＝0.03扭轉(zhuǎn)離開(kāi)了平面構(gòu)型，影響了p-p共軛作用35Ff＝0.75Ff＝0.03扭轉(zhuǎn)離開(kāi)了平面構(gòu)型，影響了p-p順式二苯乙烯無(wú)熒光反式二苯乙烯強(qiáng)熒光36順式二苯乙烯反式二苯乙烯363.取代基的作用

給電子基增強(qiáng)熒光：－OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N吸電子基減弱熒光：－COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I與體系作用小的取代基影響不明顯：－SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。COOHNO2I無(wú)熒光NH2OH比熒光強(qiáng)50倍373.取代基的作用給電子基增強(qiáng)熒光：COOHNO

取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強(qiáng)分子平面性和剛性會(huì)加強(qiáng)熒光:堿性有熒光COOHOH無(wú)熒光OHCOOH水楊酸中性、堿性均有熒光OHOHCO38取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強(qiáng)分子平面性和（三）熒光試劑熒光胺鄰苯二甲醛（OPA）1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（Dansyl-Cl，丹酰氯）測(cè)定無(wú)機(jī)離子的熒光試劑39（三）熒光試劑熒光胺39有機(jī)化合物的熒光分析(1)熒光胺(2)鄰苯二甲醛(3)丹酰氯熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺類(lèi)形成的衍生物有高強(qiáng)度熒光40有機(jī)化合物的熒光分析熒光胺及其水解熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺NOHHOOHN=NHOSO3Na8－羥基喹啉(Al,Be等)茜素紫醬R(Al,F-等)用于測(cè)定無(wú)機(jī)離子的有機(jī)試劑CCOOHH安息香(B,Zn,Ge,Si等)黃酮醇(Zr,Sn等)OOHO41NOHHOOHN=NHOSO3Na8－羥基喹啉(Al,Be等三、影響熒光強(qiáng)度的主要因素內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響外部因素：外界條件對(duì)熒光效率的影響42三、影響熒光強(qiáng)度的主要因素內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響。物質(zhì)分子有強(qiáng)的紫外吸收和一定的熒光產(chǎn)率是發(fā)射熒光的兩個(gè)必備條件。分子結(jié)構(gòu)中有π→π﹡躍遷（K帶強(qiáng)吸收）或n→π﹡躍遷（R帶弱吸收）。⑴長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)：分子中必須具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)。共軛度越大，發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)移，發(fā)光強(qiáng)度增加。⑵分子的剛性和共平面性：具有剛性平面性結(jié)構(gòu)的分子熒光量子產(chǎn)率高。⑶取代基的影響：給電子取代基使熒光強(qiáng)度增大；而吸電子取代基則使熒光強(qiáng)度降低。1.內(nèi)部因素43內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響。物質(zhì)分子有強(qiáng)的紫外吸收和長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)示例苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36維生素Aλex＝327nm；λem＝510nm44長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)示例苯萘蒽維生素Aλex＝327nm；λem＝5剛性和共平面結(jié)構(gòu)示例形成絡(luò)合物后，如果分子的剛性和共平面性增強(qiáng)，可使熒光增強(qiáng)。聯(lián)苯f＝0.2芴f＝1.08-羥基喹啉8-羥基喹啉鎂45剛性和共平面結(jié)構(gòu)示例形成絡(luò)合物后，如果分子的剛性和共平面性增空間位阻使分子共平面性下降，熒光減弱。順?lè)串悩?gòu)體：反式分子有熒光，而順式分子沒(méi)有熒光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有強(qiáng)烈熒光，而順式無(wú)熒光。①1-二甲胺基萘-7-磺酸鹽②1-二甲胺基萘-8-磺酸鹽f＝0.75f＝0.0346空間位阻使分子共平面性下降，熒光減弱。順?lè)串悩?gòu)體：反式分子有取代基作用第一類(lèi)取代基是給電子基團(tuán)，能增加分子的電子共軛程度，使熒光效率提高，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移。如：－NH2、－OH、－OCH3、－NHR、－CN等。第二類(lèi)取代基是吸電子基團(tuán)，會(huì)妨礙分子的電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。如：－COOH、－NO2、－CO、－NO、－SH、－NHCOCH3、－X(鹵素原子序數(shù)↑，熒光效率↓)等。第三類(lèi)取代基對(duì)電子共軛體系作用較小，對(duì)熒光的影響不明顯。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。47取代基作用47表苯環(huán)上取代基對(duì)熒光的影響化合物分子式λF/nm相對(duì)熒光強(qiáng)度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I-0苯酚C6H5OH285-36518苯酚陰離子C6H5O-310-40010甲氧基苯C6H5OCH3285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺正離子C6H5NH3+-0苯甲酸C6H5COOH310-3903腈基苯C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-048表苯環(huán)上取代基對(duì)熒光的影響化合物分子式λF/nm相對(duì)熒光強(qiáng)外部因素：外界條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響⑴溫度的影響：溫度降低會(huì)使熒光強(qiáng)度增大；溫度升高熒光強(qiáng)度減小。⑵溶劑的影響：溶劑極性增加有時(shí)會(huì)使熒光強(qiáng)度增加，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移；溶劑的黏度減小，熒光強(qiáng)度減弱。⑶pH的影響：對(duì)于弱酸或弱堿性熒光物質(zhì)，溶液的pH值改變，影響其解離平衡，使熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。⑷熒光熄滅的影響：熒光物質(zhì)與熒光熄滅劑相互作用，引起熒光強(qiáng)度降低。⑸散射光的干擾：瑞利光和拉曼光。2.外部因素49外部因素：外界條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響2.外部因素49溫度：T低，φf(shuō)增加。熒光素鈉的乙醇溶液,T<0℃時(shí),每降低10℃,φ增加3%,-80℃時(shí)φ=100%.50溫度：T低，φf(shuō)增加。50溶劑的極性：電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)的極性大，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度增大，熒光波長(zhǎng)紅移。溶劑相對(duì)介電常數(shù)熒光峰l/nm熒光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巰基喹啉在不同溶劑中的熒光峰和熒光效率51溶劑的極性：電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)的極性大，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光強(qiáng)pH值影響熒光強(qiáng)度示例

pH值：<27～12>13存在形式：離子分子離子有無(wú)熒光：無(wú)藍(lán)色熒光無(wú)52pH值影響熒光強(qiáng)度示例pH值：<2熄滅劑：鹵素離子、重金屬離子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。瑞利光(Reyleighscatteringlight)：光子與分子發(fā)生彈性碰撞時(shí)，僅改變光子運(yùn)動(dòng)方向，不發(fā)生能量交換，這種散射光稱(chēng)為瑞利光。

特點(diǎn)：波長(zhǎng)與入射光相同。53熄滅劑：53拉曼光(Ramanscatteringlight)：光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時(shí)，不僅改變光子運(yùn)動(dòng)方向，而且發(fā)生能量交換，這種散射光稱(chēng)為拉曼光。特點(diǎn)：當(dāng)光子失去部分能量時(shí)，波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng)，干擾最大；當(dāng)光子多得到部分能量時(shí)，波長(zhǎng)比入射光短。消除方法：選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長(zhǎng)可消除拉曼光干擾。54拉曼光(Ramanscatteringlight)：54例如：硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜55例如：硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜55320448448360320350400350激發(fā)350nm硫酸奎寧激發(fā)320nm硫酸奎寧激發(fā)350nm0.1mol/LH2SO4激發(fā)320nm0.1mol/LH2SO4強(qiáng)度(a)強(qiáng)度(b)λ/nmλ/nmλ/nmλ/nm圖11-6硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜56320448448360320350400350激發(fā)350n熒光是物質(zhì)吸收光子之后發(fā)出的光，熒光強(qiáng)度(F)與熒光物質(zhì)吸收光的程度以及發(fā)射熒光的能力有關(guān)。測(cè)試熒光的方向與激發(fā)光入射方向垂直，吸收池是四面透光的。熒光分析定量依據(jù)：熒光強(qiáng)度F與濃度c成線(xiàn)性關(guān)系。第二節(jié)熒光定量分析方法57熒光是物質(zhì)吸收光子之后發(fā)出的光，熒光強(qiáng)度(F)與熒光物質(zhì)吸收Fc一般當(dāng)εbc0.05時(shí),F與c呈線(xiàn)性關(guān)系高濃度時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)生自熄滅和自吸收現(xiàn)象，使F與c不呈線(xiàn)性關(guān)系Fc58Fc一般當(dāng)εbc0.05時(shí),F與c呈線(xiàn)性關(guān)系二、定量分析方法1.校正曲線(xiàn)法2.比例法3.聯(lián)立方程式法59二、定量分析方法1.校正曲線(xiàn)法591、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法1）確定ex和em(激發(fā)光譜和發(fā)射光譜)；2）確定適宜的條件:試劑濃度、pH、T、t等；3）以標(biāo)準(zhǔn)溶液做工作曲線(xiàn)；4）測(cè)未知樣的熒光強(qiáng)度(F),根據(jù)工作曲線(xiàn)計(jì)算熒光物質(zhì)的濃度.601、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法1）確定ex和em(激發(fā)光譜和發(fā)射光譜)2、比例法：若標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)原點(diǎn)，在線(xiàn)性范圍內(nèi)可采用比例法(只需1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液)；若標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不通過(guò)原點(diǎn)，則應(yīng)扣除空白溶液的熒光強(qiáng)度后再計(jì)算：3、聯(lián)立方程式法：多組分混合物的熒光分析6161第三節(jié)熒光分光光度計(jì)及其他熒光分析技術(shù)I0ItF氙燈(或高壓汞燈）（200-800nm)光電倍增管圖11-7熒光分光光度計(jì)示意圖62第三節(jié)熒光分光光度計(jì)及其他熒光分析技術(shù)I0ItF氙燈(或熒光儀部件激發(fā)光源:

能夠在紫外-可見(jiàn)光區(qū)連續(xù)發(fā)光，常用氙燈、高壓汞燈或激光光源.樣品池:石英池,四壁透明.單色器:

兩個(gè)光柵單色器,分置于樣品池前后.檢測(cè)器:光電池或光電倍增管,

與激發(fā)光成直角的方向檢測(cè)熒光.63熒光儀部件激發(fā)光源:能夠在紫外-可見(jiàn)光區(qū)連續(xù)發(fā)光，63熒光光度計(jì)光路圖電源光度計(jì)記錄儀光電倍增管試樣液池光源光柵光柵反射鏡反射鏡激發(fā)單色器發(fā)射單色器64熒光光度計(jì)光路圖電源光度計(jì)記錄儀光電倍增管試樣液池光源光柵光儀器的校正靈敏度校正波長(zhǎng)校正激發(fā)光譜和熒光光譜校正65儀器的校正靈敏度校正65二、其他熒光分析技術(shù)簡(jiǎn)介（自學(xué)）激光分析技術(shù)時(shí)間分辨熒光分析同步熒光分析膠束增敏熒光分析66二、其他熒光分析技術(shù)簡(jiǎn)介（自學(xué)）激光分析技術(shù)66

熒光光度法的應(yīng)用

生物化學(xué)分析，生理醫(yī)學(xué)研究，臨床檢測(cè).直接測(cè)定能產(chǎn)生熒光的物質(zhì).

帶苯環(huán)的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸.測(cè)定能與熒光試劑反應(yīng)生成熒光化合物的物質(zhì).熒光生色團(tuán)標(biāo)記蛋白質(zhì)，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；致癌物同核酸結(jié)合常引起顯著的熒光；無(wú)機(jī)離子（Mg2+、Al3+、Zn2+、Be+等）可同試劑形成熒光絡(luò)合物。熒光熄滅法測(cè)定猝滅劑Ni2+對(duì)Al-PAN絡(luò)合物有熒光猝滅作用，可測(cè)Ni2+（

6×10-5～6×10-3

g·mL-1）67熒光光度法的應(yīng)用 生物化學(xué)分析，生理醫(yī)學(xué)研究，臨床檢測(cè).6舉例—痕量3,4-苯并芘的測(cè)定:

苯并芘萃?。ōh(huán)己酮或石油醚）→濃縮→層析→以H2SO4溶解苯并芘→熒光分析熒光測(cè)定：

ex=520nm

em=545nm68舉例—痕量3,4-苯并芘的測(cè)定:苯并芘萃?。ōh(huán)己酮或石油復(fù)習(xí)分子熒光的發(fā)生過(guò)程激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光光譜的特征分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系影響熒光強(qiáng)度的因素?zé)晒舛糠治龇椒ā?9復(fù)習(xí)分子熒光的發(fā)生過(guò)程69課堂復(fù)習(xí)(1)下列敘述中正確的是(

)。a.熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。b.受激分子從激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)返回至基態(tài)時(shí)所發(fā)出的光稱(chēng)為熒光。c.熒光波長(zhǎng)短于激發(fā)光波長(zhǎng)。d.磷光波長(zhǎng)短于熒光波長(zhǎng)。(2)熒光分光光度法是屬于:（

）

a.發(fā)射光譜法;

b.吸收光譜法;

c.拉曼光譜法;

d.熒光光譜法;

(3)從化合物的分子結(jié)構(gòu)，推斷熒光最強(qiáng)的是:（

）

a.苯

b.

萘

c.1-氯萘

d.蒽(4)熒光定量分析中，測(cè)定的是（

）

a.拉曼光

b.發(fā)射光

c.瑞麗光

d.磷光aadb70課堂復(fù)習(xí)(1)下列敘述中正確的是(

)。aa

作業(yè)：p-225：1、571作業(yè)：p-225：1、571

結(jié)束語(yǔ)謝謝大家聆聽(tīng)！??！72

結(jié)束語(yǔ)謝謝大家聆聽(tīng)?。?！7211分子熒光分析法11分子熒光分析法基本要求掌握分子熒光的發(fā)生過(guò)程，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，熒光光譜的特征，分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系；影響熒光強(qiáng)度的因素，熒光定量分析方法。熟悉分子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的各種途徑，熒光壽命與熒光效率。了解熒光分光光度計(jì)與其他熒光分析技術(shù)。74基本要求掌握分子熒光的發(fā)生過(guò)程，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，熒光光譜最新11分子熒光分析法課件最新11分子熒光分析法課件最新11分子熒光分析法課件最新11分子熒光分析法課件最新11分子熒光分析法課件最新11分子熒光分析法課件一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1、分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程分子的多重性M:M=2s+1，s表示總自旋量子數(shù)，s=0時(shí)分子所處的電子能態(tài)為單重態(tài)，用S來(lái)表示；s=1時(shí)分子所處的電子能態(tài)為三重態(tài)，用T來(lái)表示；81一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1、分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程光吸收過(guò)程失活過(guò)程發(fā)光失活分子間能量轉(zhuǎn)移失活非輻射失活熒光磷光振動(dòng)馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間跨躍2.熒光的產(chǎn)生82光吸收過(guò)程失活過(guò)程發(fā)光失活分子間能量轉(zhuǎn)移失活非輻射失活熒光磷吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳豫外轉(zhuǎn)換基態(tài)熒光壽命:10－9～10－7s磷光壽命:10－4～10s圖11-2熒光和磷光產(chǎn)生示意圖83吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳輻射躍遷－發(fā)光失活熒光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)單線(xiàn)態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。磷光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)三重態(tài)T1的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。波長(zhǎng)關(guān)系：激發(fā)光＜熒光＜磷光。84輻射躍遷－發(fā)光失活12無(wú)輻射失活a.振動(dòng)弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級(jí)中的較高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程，其效率較高b.內(nèi)轉(zhuǎn)換：當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非常接近以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，電子由高能級(jí)回到低能級(jí)的過(guò)程。85無(wú)輻射失活13無(wú)輻射失活c.外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑、溶質(zhì)分子之間發(fā)生相互碰撞而失去能量的過(guò)程。d.系間跨越：激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過(guò)程。86無(wú)輻射失活14吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳豫外轉(zhuǎn)換基態(tài)熒光壽命:10－9～10－7s磷光壽命:10－4～10s圖11-2熒光和磷光產(chǎn)生示意圖87吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳結(jié)論：熒光是來(lái)自最低激發(fā)單重態(tài)的輻射躍遷過(guò)程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光過(guò)程的速率常數(shù)大，激發(fā)壽命短；磷光是來(lái)自最低激發(fā)三重態(tài)的輻射躍遷過(guò)程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光過(guò)程的速率常數(shù)小，激發(fā)壽命相對(duì)比較長(zhǎng)。88結(jié)論：熒光是來(lái)自最低激發(fā)單重態(tài)的輻射躍遷過(guò)程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象復(fù)習(xí)：熒光的產(chǎn)生基態(tài)分子hv激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，如何回去？89復(fù)習(xí)：基態(tài)分子hv激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，如何回去？17S2S0S1T1l2l1分子的吸收情況90S2S0S1T1l2l1分子的吸收情況18S2S0S1T1l2l1振動(dòng)弛豫：在同一電子能級(jí)（激發(fā)態(tài)）…特點(diǎn)：無(wú)輻射；速率快（10-14～10-12s內(nèi)完成）91S2S0S1T1l2l1振動(dòng)弛豫：在同一電子能級(jí)（激發(fā)態(tài)）…S2S0S1T1l2l1內(nèi)轉(zhuǎn)移（internalconversion)：相同多重性的兩個(gè)電子能級(jí)之間的非輻射躍遷92S2S0S1T1l2l1內(nèi)轉(zhuǎn)移（internalconveS2S0S1T1l2l1l3熒光發(fā)射Fluorescence93S2S0S1T1l2l1l3熒光發(fā)射Fluorescencel1l2l3l3>l1>l2Onlyl394l1l2l3l3>l1>l222S2S0S1T1l2l1系間跨躍磷光發(fā)射l4IntersystemCrossingPhosphorescence95S2S0S1T1l2l1系間跨躍磷光發(fā)射l4IntersysS0S1T1l2l1外轉(zhuǎn)移

ExternalConversion96S0S1T1l2l1外轉(zhuǎn)移ExternalConvers復(fù)習(xí)分子熒光的發(fā)生過(guò)程基態(tài)分子概念：基態(tài)、激發(fā)態(tài)（激發(fā)單重態(tài)S*、激發(fā)三重態(tài)T*）能量傳遞過(guò)程：1、無(wú)輻射躍遷（振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換、外轉(zhuǎn)換、系間跨越）2、輻射躍遷（熒光、磷光）97復(fù)習(xí)分子熒光的發(fā)生過(guò)程25吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳豫外轉(zhuǎn)換基態(tài)熒光壽命:10－9～10－7s磷光壽命:10－4～10s圖11-2熒光和磷光產(chǎn)生示意圖98吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫系間跨躍振動(dòng)馳（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光物質(zhì)分子都具有兩個(gè)特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）。激發(fā)光譜：不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)熒光的相對(duì)效率。熒光光譜：在所發(fā)射的熒光中各種波長(zhǎng)組分的相對(duì)強(qiáng)度。圖11-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜99（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光物質(zhì)分子都具有兩個(gè)特征光譜激發(fā)光譜和發(fā)射光譜具有三個(gè)特點(diǎn)：⑴斯托克斯位移，波長(zhǎng)：熒光＞激發(fā)光；⑵熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)；⑶熒光光譜和激發(fā)光譜大致成鏡像關(guān)系。圖11-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜100激發(fā)光譜和發(fā)射光譜具有三個(gè)特點(diǎn)：圖11-3蒽的激發(fā)光譜和蒽的激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光光譜)激發(fā)光譜:ExcitationSpectrum,激發(fā)波長(zhǎng):ex發(fā)射光譜EmissionSpectrum,發(fā)射波長(zhǎng):em圖11-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜b0b1b2b3c3c2c1c0101蒽的激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光光譜)激發(fā)光譜:Ex二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率熒光壽命(τf)：

除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到激發(fā)時(shí)最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間稱(chēng)為熒光壽命(10-8～10-10s)。熒光物質(zhì)受到一個(gè)極短時(shí)間的脈沖光激發(fā)后，熒光強(qiáng)度從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的變化，可用指數(shù)衰減定律表示

Ft=F0e-Kt，推導(dǎo)得lnF0/Ft=t/τf

F0、Ft

：開(kāi)始時(shí)和t時(shí)的熒光強(qiáng)度，

K為衰減常數(shù)。102二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率熒光壽命(τf)：熒光效率(f)：又稱(chēng)為熒光量子產(chǎn)率或熒光產(chǎn)率。10331（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1.共軛效應(yīng)

→*躍遷芳香族化合物、五元雜環(huán)上取代苯基.

共軛體系越大,越易產(chǎn)生熒光,熒光效率也增大.─(CH=CH)3─

φ=0.68─(CH=CH)2─φ=0.28104（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1.共軛效應(yīng)→2.剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)酚酞(無(wú)熒光)8－羥基喹啉(弱熒光)紅色熒光CO-OOCOO-COCOO--ONO-NOMgNO熒光黃1052.剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)酚酞(無(wú)熒光)8－羥基喹啉(弱熒光聯(lián)二苯φ=0.2芴φ=1.03,4-苯并芘(強(qiáng)熒光物質(zhì))CH2106聯(lián)二苯φ=0.2芴φ=1.03,4-苯并芘(強(qiáng)Ff＝0.75Ff＝0.03扭轉(zhuǎn)離開(kāi)了平面構(gòu)型，影響了p-p共軛作用107Ff＝0.75Ff＝0.03扭轉(zhuǎn)離開(kāi)了平面構(gòu)型，影響了p-p順式二苯乙烯無(wú)熒光反式二苯乙烯強(qiáng)熒光108順式二苯乙烯反式二苯乙烯363.取代基的作用

給電子基增強(qiáng)熒光：－OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N吸電子基減弱熒光：－COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I與體系作用小的取代基影響不明顯：－SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。COOHNO2I無(wú)熒光NH2OH比熒光強(qiáng)50倍1093.取代基的作用給電子基增強(qiáng)熒光：COOHNO

取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強(qiáng)分子平面性和剛性會(huì)加強(qiáng)熒光:堿性有熒光COOHOH無(wú)熒光OHCOOH水楊酸中性、堿性均有熒光OHOHCO110取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強(qiáng)分子平面性和（三）熒光試劑熒光胺鄰苯二甲醛（OPA）1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（Dansyl-Cl，丹酰氯）測(cè)定無(wú)機(jī)離子的熒光試劑111（三）熒光試劑熒光胺39有機(jī)化合物的熒光分析(1)熒光胺(2)鄰苯二甲醛(3)丹酰氯熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺類(lèi)形成的衍生物有高強(qiáng)度熒光112有機(jī)化合物的熒光分析熒光胺及其水解熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺NOHHOOHN=NHOSO3Na8－羥基喹啉(Al,Be等)茜素紫醬R(Al,F-等)用于測(cè)定無(wú)機(jī)離子的有機(jī)試劑CCOOHH安息香(B,Zn,Ge,Si等)黃酮醇(Zr,Sn等)OOHO113NOHHOOHN=NHOSO3Na8－羥基喹啉(Al,Be等三、影響熒光強(qiáng)度的主要因素內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響外部因素：外界條件對(duì)熒光效率的影響114三、影響熒光強(qiáng)度的主要因素內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響。物質(zhì)分子有強(qiáng)的紫外吸收和一定的熒光產(chǎn)率是發(fā)射熒光的兩個(gè)必備條件。分子結(jié)構(gòu)中有π→π﹡躍遷（K帶強(qiáng)吸收）或n→π﹡躍遷（R帶弱吸收）。⑴長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)：分子中必須具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)。共軛度越大，發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)移，發(fā)光強(qiáng)度增加。⑵分子的剛性和共平面性：具有剛性平面性結(jié)構(gòu)的分子熒光量子產(chǎn)率高。⑶取代基的影響：給電子取代基使熒光強(qiáng)度增大；而吸電子取代基則使熒光強(qiáng)度降低。1.內(nèi)部因素115內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響。物質(zhì)分子有強(qiáng)的紫外吸收和長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)示例苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36維生素Aλex＝327nm；λem＝510nm116長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)示例苯萘蒽維生素Aλex＝327nm；λem＝5剛性和共平面結(jié)構(gòu)示例形成絡(luò)合物后，如果分子的剛性和共平面性增強(qiáng)，可使熒光增強(qiáng)。聯(lián)苯f＝0.2芴f＝1.08-羥基喹啉8-羥基喹啉鎂117剛性和共平面結(jié)構(gòu)示例形成絡(luò)合物后，如果分子的剛性和共平面性增空間位阻使分子共平面性下降，熒光減弱。順?lè)串悩?gòu)體：反式分子有熒光，而順式分子沒(méi)有熒光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有強(qiáng)烈熒光，而順式無(wú)熒光。①1-二甲胺基萘-7-磺酸鹽②1-二甲胺基萘-8-磺酸鹽f＝0.75f＝0.03118空間位阻使分子共平面性下降，熒光減弱。順?lè)串悩?gòu)體：反式分子有取代基作用第一類(lèi)取代基是給電子基團(tuán)，能增加分子的電子共軛程度，使熒光效率提高，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移。如：－NH2、－OH、－OCH3、－NHR、－CN等。第二類(lèi)取代基是吸電子基團(tuán)，會(huì)妨礙分子的電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。如：－COOH、－NO2、－CO、－NO、－SH、－NHCOCH3、－X(鹵素原子序數(shù)↑，熒光效率↓)等。第三類(lèi)取代基對(duì)電子共軛體系作用較小，對(duì)熒光的影響不明顯。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。119取代基作用47表苯環(huán)上取代基對(duì)熒光的影響化合物分子式λF/nm相對(duì)熒光強(qiáng)度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I-0苯酚C6H5OH285-36518苯酚陰離子C6H5O-310-40010甲氧基苯C6H5OCH3285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺正離子C6H5NH3+-0苯甲酸C6H5COOH310-3903腈基苯C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-0120表苯環(huán)上取代基對(duì)熒光的影響化合物分子式λF/nm相對(duì)熒光強(qiáng)外部因素：外界條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響⑴溫度的影響：溫度降低會(huì)使熒光強(qiáng)度增大；溫度升高熒光強(qiáng)度減小。⑵溶劑的影響：溶劑極性增加有時(shí)會(huì)使熒光強(qiáng)度增加，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移；溶劑的黏度減小，熒光強(qiáng)度減弱。⑶pH的影響：對(duì)于弱酸或弱堿性熒光物質(zhì)，溶液的pH值改變，影響其解離平衡，使熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。⑷熒光熄滅的影響：熒光物質(zhì)與熒光熄滅劑相互作用，引起熒光強(qiáng)度降低。⑸散射光的干擾：瑞利光和拉曼光。2.外部因素121外部因素：外界條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響2.外部因素49溫度：T低，φf(shuō)增加。熒光素鈉的乙醇溶液,T<0℃時(shí),每降低10℃,φ增加3%,-80℃時(shí)φ=100%.122溫度：T低，φf(shuō)增加。50溶劑的極性：電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)的極性大，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度增大，熒光波長(zhǎng)紅移。溶劑相對(duì)介電常數(shù)熒光峰l/nm熒光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巰基喹啉在不同溶劑中的熒光峰和熒光效率123溶劑的極性：電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)的極性大，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光強(qiáng)pH值影響熒光強(qiáng)度示例

pH值：<27～12>13存在形式：離子分子離子有無(wú)熒光：無(wú)藍(lán)色熒光無(wú)124pH值影響熒光強(qiáng)度示例pH值：<2熄滅劑：鹵素離子、重金屬離子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。瑞利光(Reyleighscatteringlight)：光子與分子發(fā)生彈性碰撞時(shí)，僅改變光子運(yùn)動(dòng)方向，不發(fā)生能量交換，這種散射光稱(chēng)為瑞利光。

特點(diǎn)：波長(zhǎng)與入射光相同。125熄滅劑：53拉曼光(Ramanscatteringlight)：光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時(shí)，不僅改變光子運(yùn)動(dòng)方向，而且發(fā)生能量交換，這種散射光稱(chēng)為拉曼光。特點(diǎn)：當(dāng)光子失去部分能量時(shí)，波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng)，干擾最大；當(dāng)光子多得到部分能量時(shí)，波長(zhǎng)比入射光短。消除方法：選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長(zhǎng)可消除拉曼光干擾。126拉曼光(Ramanscatteringlight)：54例如：硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜127例如：硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜55320448448360320350400350激發(fā)350nm硫酸奎寧激發(fā)320nm硫酸奎寧激發(fā)350nm0.1mol/LH2SO4激發(fā)320nm0.1mol/LH2SO4強(qiáng)度(a)強(qiáng)度(b)λ/nmλ/nmλ/nmλ/nm圖11-6硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜128320448448360320350400350激發(fā)350n熒光是物質(zhì)吸收光子之后發(fā)出的光，熒光強(qiáng)度(F)與熒光物質(zhì)吸收光的程度以及發(fā)射熒光的能力有關(guān)。測(cè)試熒光的方向與激發(fā)光入射方向垂直，吸收池是四面透光的。熒光分析定量依據(jù)：熒光強(qiáng)度F與濃度c成線(xiàn)性關(guān)系。第二節(jié)熒光定量分析方法129熒光是物質(zhì)吸收光子之后發(fā)出的光，熒光強(qiáng)度(F)與熒光物質(zhì)吸收Fc一般當(dāng)εbc0.05時(shí),F與c呈線(xiàn)性關(guān)系高濃度時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)生自熄滅和自吸收現(xiàn)象，使F與c不呈線(xiàn)性關(guān)系Fc130Fc一般當(dāng)εbc0.05時(shí),F與c呈線(xiàn)性關(guān)系二、定量分析方法1.校正曲線(xiàn)法2.比例法3.聯(lián)立方程式法131二、定量