基因工程基礎知識填空【實用文檔】doc文檔可直接使用可編輯，歡迎下載

專題一基因工程基因工程基礎知識填空【實用文檔】doc文檔可直接使用可編輯，歡迎下載1。1DＮA重組技術的基本工具一、基因工程的基本概念1.概念：基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴格的設計，并通過＿__＿_________和______＿____等技術,賦予生物以新的__＿＿__＿___，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的_＿__＿_＿＿_＿和＿________＿_。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的,因此又叫做___＿_＿________＿_＿。2。基本原理：＿__＿_＿_＿______３.理論基礎（１)不同生物的基因可以拼接的結(jié)構基礎-—細胞生物的遺傳物質(zhì)都是＿______，都是以_________＿___為基本單位構成的雙鏈大分子。（2）目的基因轉(zhuǎn)入后可以表達的基礎——所有生物共用一套_____＿____。（3）生物遺傳信息的表達都遵循___＿＿＿_＿＿.4。優(yōu)點（1）目的性強，能＿__＿___的改造生物的性狀.（2）克服_＿＿＿＿____＿______的障礙。二、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術刀１．簡稱:________＿＿.２。來源：主要是從________＿_中分離純化而來。3。功能特點：特異性，即識別雙鏈ＤＮＡ分子某種特定＿____＿____，并且使每一條鏈中__＿＿_＿_____＿的兩個核苷酸之間的__＿______斷開.4．酶切結(jié)果：_＿_＿___末端和_______末端。畫出EcｏRⅠ酶切后的結(jié)果：↓GAATTCCＴTＡAＧ↑三、ＤNＡ連接酶——“分子縫合針”１．作用實質(zhì):將雙鏈DNA片段“縫合"起來,恢復被限制酶切開了的兩個核苷酸之間的_＿＿＿_＿__。2.作用前提:兩個ＤNA分子必須含有＿__＿＿___＿。３.種類(１)E·ｃoliDNA連接酶①來源:＿＿＿_＿_＿____②功能：只能連接_＿＿_______＿(２）T４DＮA連接酶①來源：_＿__＿_＿_＿__＿②功能：既可以連接___＿__＿_＿__，又可以連接＿____＿___，但連接＿________時效率比較低?！就卣埂勘容^DNA連接酶與DNA聚合酶DＮA連接酶DNＡ聚合酶作用實質(zhì)都是催化兩個核苷酸之間形成＿_＿__＿_是否需模板_＿＿___＿＿_＿____連接DNA鏈____鏈＿___鏈作用過程在兩個ＤＮA片段之間形成__________將____＿__＿_加到已存在的核苷酸鏈上,形成____＿__＿_＿__作用結(jié)果將兩個DNA片段連接成_____＿＿___合成______＿_＿__四、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”1．基因工程中最常用的載體——___＿_＿_(１）來源:_＿__＿__＿等微生物（２）結(jié)構：裸露的、結(jié)構簡單、獨立于___＿______＿之外，并具有＿＿_______＿__的___＿_＿__＿_＿分子。２.基因的載體必須具備的條件（1）有____＿______＿＿_個限制酶切割位點,供外源DNA片段（基因）插入其中.（２）能在宿主細胞內(nèi)_＿＿_＿＿_＿＿，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行_______＿.(3）有特殊的________＿__,如四環(huán)素抗性基因等，供重組DNA的鑒定和選擇。(4)必須是＿_＿＿__的，不會對受體細胞有害。（5）＿___＿＿＿適合，以便提取和在體外進行操作。3.載體的種類：除質(zhì)粒外，還有_______＿____、__＿__＿_＿___＿＿_____等。4．在進行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎上進行過_______＿_的.１。2基因工程的基本操作程序一、基因工程的基本操作程序1.______＿______的獲取.2.＿___＿________的構建。3.將目的基因____＿____＿_＿_。4.目的基因的_＿_________＿_。二、目的基因的獲取1。目的基因主要是＿_____＿__的結(jié)構基因.２。獲取目的基因的方法(1)從基因文庫中獲取目的基因①基因文庫概念：將含有某種生物不同基因的許多______＿__＿,導入＿____＿＿的群體中儲存，各個__＿____分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫.②基因文庫分類：可分為_＿___＿文庫和________文庫(如ｃDNA文庫）.(2)利用PCR技術擴增目的基因①PCR技術是_＿_＿__＿＿___＿_的縮寫。PCR是一項在生物體外_＿__＿_____＿__的核酸合成技術.②PCR技術的原理：ＤNA的____＿____。③PCＲ擴增的前提：要有一段已知目的基因的_＿_＿__＿,以便根據(jù)這一序列合成引物。④PCＲ擴增的條件:_____、_____（目的基因),原料-—＿_________＿＿___（即ｄCTP、dATＰ、dGＴP、dTTP)，耐高溫的__＿＿＿_＿___酶（Taq酶）.⑤PCR擴增的過程a．變性：加熱到90－９5℃b。復性(退火）：冷卻到55-60℃ｃ。延伸：加熱到70-75℃⑥結(jié)果：目的基因以____的方式成指數(shù)形式擴增。(3）人工合成法：如果基因比較_＿＿,且________，可以通過＿＿__＿_＿__＿＿用化學方法直接人工合成?！就卣埂縋CR技術和ＤＮA復制的比較PCＲ技術DNA復制相同點原理＿_________＿_____＿_原料_________＿_____＿__條件_____、_＿___、____＿不同點解旋_＿___解旋_____＿_催化場所＿____復制_____＿__酶熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)含有的DNA聚合酶結(jié)果在短時間內(nèi)形成____＿____形成_________＿三、基因表達載體的構建基因表達載體的構建是實施基因工程的第二步,也是基因工程的_______1.基因表達載體構建目的：使目的基因在受體細胞中__________，并且可以_______給下一代，同時，使目的基因能夠＿___＿_____。2.基因表達載體的組成：除了目的基因外，還必須有_______、_＿___＿_以及＿_____＿＿__等。(１)啟動子：位于目的基因的＿______，是一段有特殊結(jié)構的DNA序列,是＿__＿_＿__＿_＿__識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出ｍRＮA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)，即轉(zhuǎn)錄開始的部位。(2）終止子:位于目的基因的______,也是一段有特殊結(jié)構的DNA序列，使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停止下來,即轉(zhuǎn)錄停止的部位。（3）標記基因:用于鑒別受體細胞中是否＿____＿_＿,從而將含有目的基因的細胞_______出來，常為＿____＿__＿____，如氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因。3．表達載體構建過程中,獲取目的基因與切割質(zhì)粒時一般用_＿_____限制性核酸內(nèi)切酶，目的是產(chǎn)生相同的_____＿_＿_＿＿，以便于連接。四、將目的基因?qū)胧荏w細胞_____＿的概念：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程,稱為_______。1.將目的基因?qū)胫参锛毎?1)常用受體細胞:植物的＿_＿＿＿_＿＿或____＿___。(2）方法：_________＿＿＿法、＿__＿_＿___法、＿__＿＿_＿＿_法,其中，＿________＿＿法是導入植物細胞最常用的方法。①農(nóng)桿菌特點:易感染雙子葉植物和裸子植物.當植物體受到傷害是,傷口處的細胞會分泌大量的__＿＿_＿＿__＿_，吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞,這時農(nóng)桿菌中的_____＿__上的_______＿(可轉(zhuǎn)移的DNA）可轉(zhuǎn)移到受體細胞染色體的ＤＮA上。②轉(zhuǎn)化過程：將______＿__插入到＿____＿＿_＿__上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，可以使目的基因進入植物細胞,并將其插入到植物細胞中染色體的DＮA，使目的基因的遺傳特性得以_＿___＿___＿____＿＿_。２.將目的基因?qū)雱游锛毎?）常用受體細胞:____＿＿____。(2）常用方法：__________＿＿__。（３）基本操作程序：＿____含有目的基因的表達載體→_＿____(受精卵）→_＿＿_＿_____→胚胎移植→新性狀動物３。將目的基因?qū)胛⑸锛毎?1)常用受體細胞：_＿＿_＿_＿_細胞，其中__＿_____最為廣泛。（2)原核生物的特點：①__＿_____；②多為單細胞;③遺傳物質(zhì)相對__＿___（３)轉(zhuǎn)化方法:__＿_＿________法。（4）轉(zhuǎn)化過程①用＿______＿_處理受體細胞(如大腸桿菌),使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DＮA分子的生理狀態(tài)，這種細胞稱為＿_________＿_。②將重組表達載體DＮA分子溶于＿＿_____中與____＿＿__混合，在一定____＿下促進＿____＿____吸收DＮＡ分子，完成轉(zhuǎn)化過程。五、目的基因的檢測與鑒定目的基因?qū)胧荏w細胞是否可以_______＿__＿___，只有通過檢測與鑒定才能知道，這是基因工程的第四步,也是檢查基因工程是否成功的一步。類型步驟檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示_＿＿＿檢測第一步檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體上是否插入了目的基因_＿＿_＿____________(ＤＮA探針+轉(zhuǎn)基因生物DNA）是否＿__＿_______第二步檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄＿______＿___＿＿___＿_(DNA探針＋轉(zhuǎn)基因生物mRNA)是否____＿_＿__＿_第三步檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)____________＿＿_____是否＿______________水平的檢測包括抗蟲、抗病的接種實驗,以確定是否具有抗性的及抗性程度；基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品的功能進行活性比較等１.3基因工程的應用一、植物基因工程碩果累累植物基因工程技術主要用于提高農(nóng)作物的__＿＿____＿___（如抗除草劑、抗蟲、抗病、抗干旱和抗鹽堿等)，以及改良農(nóng)作物的____＿＿和利用植物生產(chǎn)___＿＿__等方面。動物基因工程前景廣闊動物基因工程主要應用于動物品種______、建立___＿_＿__、器官移植等多方面.(１）用于提高動物生長速度：將__＿__＿＿___＿_＿__導入動物體內(nèi)，以提高動物生長速率。（２)用于改良畜產(chǎn)品的品質(zhì)。(3）用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物：將藥用蛋白基因與____＿＿_＿_＿__的啟動子等調(diào)控組件重組在一起，通過＿___＿＿＿___等方法,導入哺乳動物的＿_＿_＿__中,然后,將受精卵送入母體內(nèi)，使其生長發(fā)育成＿＿__＿＿_＿。轉(zhuǎn)基因動物進人泌乳期后，可以通過分泌的＿_＿___來生產(chǎn)所需要的藥品，稱為乳腺（房)生物反應器。（4）用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體:將器官供體基因組導入某種調(diào)節(jié)因子，抑制_____________或設法除去＿________＿_，再結(jié)合_＿＿___＿__＿，培育出沒有_____＿______＿_＿__的轉(zhuǎn)基因克隆動物器官.三、基因工程在醫(yī)學、藥學上的應用1?；蚬こ趟幬?利用“工程菌”生產(chǎn)基因工程藥品包括_＿__＿＿____、______、＿＿____、____＿_、______等.工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表達的菌類細胞株系一般稱為“工程菌”。2.基因治療:是把_＿_＿_____導入病人體內(nèi),使該基因的＿____＿_＿發(fā)揮功能，從而達到治療疾病的目的,這是治療遺傳病的最有效的手段,包括＿_＿＿__＿____和_＿_＿_＿_____＿。補1:用于基因治療的基因有三種類型：①＿_＿_＿＿＿____＿_______＿__＿___＿＿_＿_；②__________＿_＿_＿_______＿＿＿＿_____；③＿___＿_＿_＿_＿_＿________＿_________。補２：基因診斷。原理：__＿_______＿__;工具__＿____＿_＿_１.4蛋白質(zhì)工程1.實質(zhì)：根據(jù)的關系，通過，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造或創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì)。2．基本原理：預期→設計→推測→找到→合成3.蛋白質(zhì)工程與基因工程區(qū)別蛋白質(zhì)工程基因工程實質(zhì)通過，以定向改造或生產(chǎn)人來需要的蛋白質(zhì),甚至是自然界不存在的蛋白質(zhì)定向改造生物的遺傳特性,以獲得符合人類需要的生物類型會生物產(chǎn)品結(jié)果可以合成自然界的蛋白質(zhì)只能生產(chǎn)自然界的蛋白質(zhì)聯(lián)系蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎上，延伸出的工程基因工程的定義:按照預先設計好的藍圖,利用現(xiàn)代分子生物學技術，特別是酶學技術，對遺傳物質(zhì)DNＡ直接進行體外重組操作與改造,將一種生物(供體)的基因轉(zhuǎn)移到另外一種生物（受體）中去,從而實現(xiàn)受體生物的定向改造與改良?；蚬こ痰幕具^程:切、接、轉(zhuǎn)、增、檢基因工程理論依據(jù)：a）生物的遺傳物質(zhì)是DNA。b）DNA的雙螺旋結(jié)構和半保留復制機理.c）遺傳信息的傳遞方式(中心法則）和三聯(lián)體密碼子系統(tǒng)的建立遺傳工程：指以改變生物有機體性狀為目標，采用類似工程技術手段而進行的對遺傳物質(zhì)的操作,以改良品質(zhì)或創(chuàng)造新品種.包括細胞工程和基因工程等不同的技術層次?？寺?。指由同個祖先經(jīng)過無性繁殖方式得到的一群由遺傳上同一的DNＡ分子、細胞或個體組成的特殊生命群體。限制性核酸內(nèi)切酶。是一類能識別雙鏈DNＡ中特殊核苷酸序列,并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶。限制性內(nèi)切酶由三個基因位點所控制:hsdR-－—限制性內(nèi)切酶，hsｄＭ—-－限制性甲基化酶，ｈｓdS———控制兩個系統(tǒng)的表達.HｓdS-識別特定DＮA序列，HsdM－甲基化,HsdR-限制性內(nèi)切酶功能。命名法:例如Ｈａemoｐhｉlｕsinfｌuenzue)d株中分離的第三個酶：ＨｉndＩＩI同裂酶:不同來源的限制酶具有相同的識別位點和切割位點。同尾酶:來源不同、識別序列不同,但產(chǎn)生相同粘性末端的酶粘性末端：DNＡ末端一條鏈突出的幾個核苷酸能與另一個具有突出單鏈的DＮA末端通過互補配對粘合,這樣的DNA末端，稱之。酶活性單位.在合適的溫度和緩沖液中，在50μｌ反應體系中,1小時內(nèi)完全切割1微克DNA所需的酶量為１個酶活性單位Ｕ.星活性：指限制性內(nèi)切酶在非標準條件下,對與識別序列相似的其它序列也進行切割反應，導致出現(xiàn)非特異性的ＤNＡ片段的現(xiàn)象。引起星活性原因:若使用buｆfer不當,會有sｔaｒａctｉvｉty,而sｔaraｃｔivｉty是指限制酶對所作用的ＤNA及序列失去專一性，當酶辨認切割位置的能力降低,導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，而產(chǎn)生錯誤的結(jié)果.連桿:化學合成的8～12個核苷酸組成的寡核苷酸片段.以中線為軸兩邊對稱，其上有一種或幾種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列,酶切后可產(chǎn)生一定的粘性末端,便于與具有相同粘性末端的另一ＤNA片段連接。底物位點優(yōu)勢效應：酶對同一個DNA底物上的不同酶切位點的切割速率不同銜接頭：化學合成的寡核苷酸，含有一種以上的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列。其一端或兩端具有一種或兩種內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的黏性末端.逆轉(zhuǎn)錄酶：以mＲNA為模板合成其互補DＮA。RNＡ聚合酶：以DNA為模板合成ｍRNＡ,不需引物,但必須有啟動子。末端轉(zhuǎn)移酶:不依賴于DＮA的DNＡ聚合酶,來自于小牛胸腺組織,在DNA分子的3端增加一個或多個脫氧核苷酸。多核苷酸激酶:對核酸末端羥基進行磷酸化的酶。防止載體分子的自身環(huán)化作用：使用不同的限制酶切;堿性磷酸酶預先處理質(zhì)粒載體;DNA片段5’端脫磷酸化作用后連接。;ＤNA片段末端同聚物加尾后進行連接載體：指能夠運載外源DＮA片段（目的基因）進入受體細胞，具有自我復制能力,使外源DＮA片段在受體細胞中得到擴增和表達，不被受體細胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類ＤNA分子。功能:1運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞2為外源基因提供復制能力或整合能力3為外源基因的擴增或表達提供條作為工程載體必備的條件：具有多個單一的限制酶切位點；有復制起點，在受體細胞中能自我復制,或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制；具有篩選轉(zhuǎn)化子的選擇性標記基因;安全，不含對受體細胞有害的基因,不會任意轉(zhuǎn)入受體細胞以外的其它生物細胞中;分子量小，拷貝數(shù)多;攜帶外源基因的幅度寬.克隆載體：用于在受體細胞中進行目的基因擴增的載體.一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復制子。表達載體。指專用于在宿主細胞中高水平表達外源蛋白質(zhì)的載體,可將重組體ＤNA導入適合的受體細胞,使所載的目的基因能夠復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯.穿梭載體:能在兩種不同的生物體內(nèi)復制的載體。主要用于原核細胞與真核細胞之間進行基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒：指獨立存在于宿主細胞染色體外、能夠自我復制的DNA分子.嚴謹型質(zhì)粒：拷貝數(shù)為1至幾個的質(zhì)粒.松弛型質(zhì)粒:拷貝數(shù)多于１0個的質(zhì)粒。氯霉素擴增:用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復制時，帶有pMB1或ColＥI復制子的質(zhì)粒扔會利用豐富的原料大量復制的的現(xiàn)象.質(zhì)粒不親和性:指在無選擇壓力的情況下,兩種親緣關系密切的不同質(zhì)粒不能在同一個寄主細胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。接合質(zhì)粒。指質(zhì)粒所攜帶的基因的功能是使細胞彼此有效地接觸，以便將質(zhì)粒DNA從供體細胞轉(zhuǎn)移至受體細胞的質(zhì)粒。質(zhì)粒有哪些性質(zhì):自主復制性、可擴增性、不親和性、轉(zhuǎn)移和遷移、重組性。cos位點：指在連接酶的作用下，連接黏性末端結(jié)合形成的雙鏈ＤNＡ區(qū)段.柯斯質(zhì)粒載體:是一類人工構建的含有DNAcos位點、噬菌體包裝有關的DNＡ短序列、質(zhì)粒DNA復制起點、抗生素標記基因等元件的特殊質(zhì)粒載體.在宿主細胞中可以作為正常噬菌體進行復制，但不表達噬菌體的任何功能。人工染色體:指人工構建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。主要有酵母人工染色體（ＹＡＣ,在大規(guī)模的測序中例如人類基因組計劃是非常有用的還有用于高等生物構建基因組文庫，缺點是：1存在嵌合現(xiàn)象，嵌合體比例比較高，2YAC克隆的穩(wěn)定性差,插入片段存在重排和丟失現(xiàn)象,３插入片段的分離和純化困難，不容易與酵母自身染色體相分離。)、細菌人工染色體（BＡC）、源于噬菌體P１的人工染色體（PＡＣ),它們的特點是載體的容載能力擴大，人工染色體具備三個元件:復制起始區(qū)／自主復制序列,參與染色體DNA復制起始結(jié)構的形成;著絲粒，負責染色體向子細胞傳遞；端粒,對染色體ＤNA兩個末端起封口和保護作用。λ-DNＡ作為載體的優(yōu)點:１)λ-DＮＡ可在體外包裝成噬菌體顆粒,能高效感染大腸桿菌；2）λ—ＤNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb,遠遠大于質(zhì)粒的裝載量;3)重組λ-DＮA的篩選較為方便，可進行正向篩選和雜交篩選；4)重組λ—ＤＮA分子的提取比質(zhì)粒容易PCＲ反應體系的成份:Taｑ酶、模板DNA、引物、dNTP、PCＲ緩沖液PCＲ反應的步驟:①DNA變性：(９0℃—96℃）：雙鏈DNＡ模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。②退火：(60℃－6５℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合,形成局部雙鏈。③延伸:(７０℃－7５℃）:在Tａq酶(在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dＮTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸,合成與模板互補的DNＡ鏈。探針：具有一定序列的核苷酸片段,能與互補的核酸序列復性雜交,并且能通過適當標記進行檢測。目的基因.是指已被或欲被分離、改造、擴增和表達的特定基因或DＮA片段.基因文庫：是某種特定的生物所含有的能夠包含所有基因的足夠數(shù)目的克隆的集合cＤNA文庫。以mRNA為模板,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱為cDＮＡ文庫。構建步驟：分離純化總ＲNＡ及ｍＲNＡ；?ｃDNA第一鏈的合成?雙鏈cDNA合成?與載體重組、轉(zhuǎn)化基因組文庫：某種生物的基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌的群體中,這個群體即為這種生物的基因組文庫.探針雜交原理。任意兩條單鏈核酸分子都有相互形成堿基對的趨勢.但形成的大多數(shù)分子對由于只有少數(shù)鏈間氫鍵形成，雜交結(jié)構并不穩(wěn)定.如果多聚核苷酸鏈是互補的,堿基對的大量形成使雙鏈分子穩(wěn)定。原位雜交技術：基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列,將有放射性或非放射性的外源核酸（即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNＡ或RNA互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。ｃDNA文庫的構建步驟:分離純化總ＲNＡ及ｍRNA（Ｐ10４—110)、ｃDNA第一鏈的合成、雙鏈ｃＤNA合成、與載體重組、轉(zhuǎn)化從基因文庫中獲取目的基因的方法:ＰCR法、化學合成法、分離目的基因的方法和原理:1從生物基因組群體中分離目的基因(原核生物基因組較小，基因容易定位，用限制性內(nèi)切酶將基因組切成若干段后，用帶有標記的核酸探針，從中選出目的基因.真核生物一般通過基因組文庫的方法獲得目的基因。）2人工合成目的基因DＮＡ片段(人工合成目的基因ＤＮＡ片段有化學合成和酶促合成法兩條途徑．一般是采用ＤＮA合成儀來合成長度不是很大的DNA片段.）３PCＲ反應合成ＤNA(PCR是以ＤNA變性、復制的某些特性為原理設計）受體細胞選擇的原則;?外源DNＡ分子能穩(wěn)定存在，限制酶缺陷型;?重組基因缺陷型；?易于轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導；?易篩選?遺傳穩(wěn)定性高,易于擴大培養(yǎng);?安全性高；?內(nèi)源蛋白酶基因缺失或缺陷；?遺傳密碼無明顯偏好性;?具有較好的轉(zhuǎn)譯加工機制；?較高的理論和實踐應用價值。轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒為載體的重組ＤＮA分子引入受體細胞的過程。轉(zhuǎn)染：以噬菌體或病毒為載體的重組DNＡ分子引入受體細胞的過程。轉(zhuǎn)導：是指通過λ噬菌體(病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)的過程。感受態(tài)細胞：指處于能吸收周圍環(huán)境中DＮA分子的生理狀態(tài)的細胞.轉(zhuǎn)化率:是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率幾種常見的轉(zhuǎn)化方法:1化學轉(zhuǎn)化法:?原理:0oC、低濃度（5０~100mM）CaＣl2,Ca2+改變細胞膜的磷脂層結(jié)構，提高膜的通透性，而且增強進入細胞的DNA分子抗DNasｅ的能力。特點：操作簡便,不需特殊儀器,一般實驗室均可進行。2電激法?原理：利用高壓電脈沖作用，在細菌細胞膜上進行電穿孔,形成可逆的瞬間通道,促進外源DNA的有效吸收。?特點：感受態(tài)細胞制備簡單；用途廣泛，但需特殊儀器電激儀。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、噬菌體轉(zhuǎn)化。正向選擇?重組子在培養(yǎng)基上能生長，而非重組子不能生長。根據(jù)插入序列的表型特征進行篩選:1限制性內(nèi)切酶法：可以通過限制性酶酶切重組質(zhì)粒,電泳分析插入片段長度是否正確。2PCＲ法：如果已知插入DNA片段的某些序列,就可以通過PCR的方法進行鑒定。3菌落原位雜交法：直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移到雜交膜上,不必進行核酸分離純化、限制酶酶切及凝膠電泳分離等操作,而是經(jīng)溶菌和變性處理后使DＮA暴露出來并與雜交膜結(jié)合,再與特異性標記探針雜交,篩選出含有插入序列的菌落或噬菌斑。4基因產(chǎn)物檢測法：如果使用的是表達載體,那么就可以通過鑒定基因產(chǎn)物的方法鑒定正確的克隆.α-互補：laｃZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體lacZ’可以與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β—半乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補。根據(jù)載體的選擇標記的初步篩選：①抗藥性選擇標記插入失活/插入表達篩選法（正向選擇?重組子在培養(yǎng)基上能生長，而非重組子不能生長。）②β-半乳糖苷酶顯色反應篩選法（α—互補篩選）(α—互補概念)③利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞（通過不同報告基因產(chǎn)生不同的酶而采用不同的手段篩選)④利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞外源基因表達系統(tǒng)：指目的基因與表達載體重組后,導入合適的受體細胞，并能在其中有效表達，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。大腸桿菌基因表達載體的重要組成元件:?復制起始區(qū)(oｒｉ）?選擇標記?正確插入的多克隆位點（控制有效轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控）?啟動子：Lａc和Tac；PL和PR；T７?核糖體結(jié)合位點?翻譯起始點AUG等真核基因在大腸桿菌中表達遇到的問題和對策：細菌不能識別真核基因的表達信號.解決的方法是將外源基因插入載體中，使其處于一系列的E.colｉ表達信號的控制之下。這樣基因可以轉(zhuǎn)錄和表達.克隆載體提供了表達的信號，所以可以用來生產(chǎn)重組蛋白,被稱為表達載體。或者:1)外源基因可能含有內(nèi)元。E．colｉ缺乏切除內(nèi)元的機制。２）外源基因可能含有在E.coｌi作為終止子的序列。3）基因的密碼子可能不適合于E.cｏli中翻譯。解決策略：1)如果克隆的基因含有內(nèi)元，可以使用mRNA。2）定點突變的方法改變可能的終止序列。3用E。coli偏愛的密碼子.融合蛋白：將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，沒有改變兩個基因的閱讀框，以這種形式表達的蛋白，稱之.分泌型蛋白：外源基因的表達產(chǎn)物N端連有一信號肽序列,通過運輸和分泌的方式穿過細胞的外膜進入培養(yǎng)基中.包涵體:一定條件下，外源基因表達產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚集在一起形成無膜的裸露結(jié)構,稱為包涵體。基因表達產(chǎn)物的檢測方法：?報告基因的酶法檢測?酶聯(lián)免疫吸附法?Weｓterｎ印跡法?表達產(chǎn)物生物學活性檢測植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法：1直接基因轉(zhuǎn)移技術(基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導轉(zhuǎn)化方法）2生物介導的轉(zhuǎn)化方法(農(nóng)桿菌介導和病毒介導兩種轉(zhuǎn)化方法）,常用于雙子葉植物。Ti質(zhì)粒的結(jié)構植物基因工程的應用：一。利用植物轉(zhuǎn)基因技術研究基因的表達與調(diào)控(可以利用報告基因研究環(huán)境因素的變化對基因表達的影響;Ｔi質(zhì)粒上的T－DＮA能隨機整合入植物染色體中，因而已廣泛應用于植物基因的定性及分離上.）二。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)（利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應器，生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)及其它高分子化合物)三.改良植物品種（可以通過轉(zhuǎn)基因來控制植物果實的成熟時間，也可以培育抗蟲害、抗病、坑除草劑和抗逆境的植物，還可以改變花型和花色及改良作物品質(zhì)）轉(zhuǎn)基因安全性:標記基因是否有害；環(huán)境危害；不同的酶對離子強度要求不同,所以當ＤＮA同時以兩種限制酶處理時,選擇可使兩種酶活性反應均可達7５﹪以上的reｓtricｔｉoｎbuｆｆｅｒ，若找不到適當?shù)模鈛ｆfｅr則先加低鹽的ｂuｆｆer使其中一酶作用后，再加入高鹽buffeｒ使另一酶作用,若無法以鹽的高低分別加入不同的ｂｕffｅr,則先加入一種buffer作用后,加9５﹪alｃohol沉淀DNA，再加另一種ｂuffｅr作用。載體的類型：?應用范圍:克隆載體、表達載體。?應用對象：原核載體、真核載體（酵母、植物和動物）、穿梭載體。?構建來源:質(zhì)粒載體、噬菌體載體、單鏈DNA噬菌體載體、粘粒載體、人工染色體載體?；蚬こ袒A知識梳理（二）三、基因工程的應用1．植物基因工程的成果提高農(nóng)作物的____＿能力、改良農(nóng)作物的品質(zhì)、利用植物生產(chǎn)_＿_＿＿等.(１)抗蟲轉(zhuǎn)基因植物①方法:將_＿__＿導入植物體，使其具有抗蟲性。②成果：各種抗蟲作物，如抗蟲水稻、抗蟲棉、抗蟲玉米等。③意義:減少＿__＿＿，降低生產(chǎn)成本,減少環(huán)境污染.④主要殺蟲基因：＿＿＿__、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物凝集素基因等。(2）抗病轉(zhuǎn)基因植物①方法：將__＿＿_導入植物體中,使其具有抗病特性。②成果:多種抗病作物,如抗病的煙草、小麥、甜椒、番茄等。③意義：提高作物抗病力,增產(chǎn)。④主要抗病基因:抗病毒的_＿_＿＿和病毒的復制酶基因；抗真菌的＿＿__＿基因和抗毒素合成基因.（3)抗逆轉(zhuǎn)基因植物①方法：將_＿_＿_基因?qū)胫参矬w，獲得抗逆作物。②成果：多種抗逆植物，如抗鹽堿和干旱的煙草、抗寒番茄、抗除草劑大豆和玉米等。③意義：提高作物抗逆能力,穩(wěn)定高產(chǎn).④主要抗逆基因：抗鹽堿、抗干旱的_＿_＿_基因、耐寒的___＿＿基因、抗除草劑基因。（４)利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)①方法：將優(yōu)良性狀基因?qū)胫参矬w，獲得__＿__。②成果:＿__＿_含量較高的玉米、耐儲存番茄、新花色的矮牽牛。③意義：改良植物的某些品種。④主要優(yōu)良性狀基因:＿＿___的蛋白質(zhì)編碼基因、控制番茄果實成熟的基因、與植物花青素代謝有關的基因.2．動物基因工程的成果（1)提高動物的生長速度①生長基因:外源__＿_＿基因.②成果：轉(zhuǎn)基因綿羊、轉(zhuǎn)基因鯉魚。（2)改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)①優(yōu)良基因:腸＿＿＿＿＿基因.②成果:轉(zhuǎn)基因牛乳汁中_＿＿_＿含量少.（3)轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物①基因來源：藥用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的__＿__.②成果：乳腺生物反應器.(４)轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體①器官供體：抑制或除去＿＿＿＿_。②成果：利用＿＿___培育沒有免疫排斥反應的豬器官。3．基因工程藥物(１)來源:轉(zhuǎn)基因＿＿＿_＿。（２）成果：_＿_＿＿、抗體、疫苗、激素等。(3）作用：預防和治療人類腫瘤、心血管疾病、遺傳病、各種傳染病、＿＿＿_＿、類風濕等疾病。4．基因治療（1）特點:把＿____導入病人體內(nèi)，使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能,從而達到治療疾病的目的。(２)成果：將腺苷酸脫氨酶基因?qū)牖颊叩腳＿＿＿_，治療復合型免疫缺陷癥.（3）方法：分為體外基因治療法和_＿__＿基因治療法。四、蛋白質(zhì)工程1．蛋白質(zhì)工程的崛起（1）實質(zhì)：將一種生物的_＿＿_＿轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，后者產(chǎn)生它本不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生新性狀。(2）目的：生產(chǎn)符合人們生活需要的、并非自然界已存在的＿__＿＿。（３)實例:天冬氨酸激酶和＿_＿____＿的活性受細胞內(nèi)__＿＿__＿＿__的影響，當賴氨酸濃度達到一定量時會抑制這兩種酶的活性，改變兩種酶的特性后，玉米游離賴氨酸含量提高。2。蛋白質(zhì)工程原理（1）目的：根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，對蛋白質(zhì)結(jié)構進行分子設計。（2）原理：__＿_＿＿____＿_＿＿＿。(3）過程：預期蛋白質(zhì)功能→設計_＿＿_＿結(jié)構→推測應有的氨基酸序列→找到對應的＿＿＿__序列（基因）。3．蛋白質(zhì)工程進展前景廣闊，但目前成功的例子不多。【答案】三、1。抗逆藥物殺蟲基因農(nóng)藥用量Ｂｔ毒蛋白基因抗病基因病毒外殼蛋白基因幾丁質(zhì)酶抗逆滲透壓調(diào)節(jié)抗凍基因優(yōu)良品質(zhì)植物賴氨酸提高必需氨基酸含量2．生長激素乳糖酶乳糖啟動子抗原決定基因克隆技術3．工程菌淋巴因子糖尿病4．正?；蛄馨图毎w內(nèi)四、1．基因蛋白質(zhì)二氫吡啶二羧酸合成酶賴氨酸濃度２．基因改造預期的蛋白質(zhì)脫氧核苷酸選修3易考知識點背誦專題1

基因工程基因工程的概念基因工程的別名

基因拼接技術或DNA重組技術操作環(huán)境

生物體外操作對象

基因操作水平

DNＡ分子水平基本過程

剪切→拼接→導入→表達結(jié)果

產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物特點

打破種的界限，定向改造生物本質(zhì)

基因重組(一）基因工程的基本工具1?！胺肿邮中g刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）（1）來源:主要是從原核生物中分離純化出來的。（2）功能：能夠識別雙鏈DNＡ分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有特異性。（3）結(jié)果:經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DＮA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。2．“分子縫合針”——ＤNA連接酶（1)兩種DＮA連接酶(E·coliDNＡ連接酶和Ｔ４－DＮA連接酶)的比較：①相同點:都縫合磷酸二酯鍵.②區(qū)別:E·coｌiＤNＡ連接酶來源于T4噬菌體，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來;而T4DNA連接酶能縫合兩種末端,但連接平末端的之間的效率較低.(2）與DＮA聚合酶作用的異同：?..?。??DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個DNA片段的末端,形成磷酸二酯鍵。3.“分子運輸車"-—載體（１）載體具備的條件:①能在受體細胞中復制并穩(wěn)定保存.②具有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入.③具有標記基因，供重組DNＡ的鑒定和選擇.（2)最常用的載體是。質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構簡單的、獨立于細菌染色體之外，并具有自我復制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。(３)其它載體：噬菌體、動植物病毒(二）基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的獲取1。目的基因是指:是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因2。獲取目的基因的方法__＿__