基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室朱金玲教授主講分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)理論

1.相關(guān)概念：分子生物學(xué)(molecularbiology)

2.生物大分子(核酸、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)、功能

實(shí)驗(yàn)技術(shù)（分子生物學(xué)技術(shù)）1.重組DNA技術(shù)（基因工程）2.核酸、蛋白質(zhì)的提取3.基因體外擴(kuò)增（PCR技術(shù)）4.分子雜交5.凝膠電泳

第一章緒論

Chapter1Introduction一、

分子生物學(xué)的概念和定義二、分子生物學(xué)發(fā)展與應(yīng)用三、分子生物學(xué)在中藥研究中的作用四、中藥研究常使的用分子生物學(xué)

技術(shù)一、分子生物學(xué)的概念和定義廣義：在分子水平上研究生命現(xiàn)象的科學(xué)。通過研究生物大分子(核酸、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)、功能和生物合成等方面來闡明各種生命現(xiàn)象的本質(zhì)。從分子水平闡明生命現(xiàn)象和生物學(xué)規(guī)律是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并正與其他學(xué)科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域。狹義：偏重于核酸（基因）的分子生物學(xué)，主要研究基因（DNA）的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和調(diào)控等過程，當(dāng)然也涉及與這些過程相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究。分子生物學(xué)所關(guān)心的主要是核酸在細(xì)胞生命過程中的作用，包括核酸本身的復(fù)制、保存以及基因的表達(dá)與調(diào)控規(guī)律，因此一般來說分子生物學(xué)是一門了解和認(rèn)識(shí)基因的課程。

生命科學(xué)的發(fā)展過程：分子水平細(xì)胞水平整體水平

分子生物學(xué)技術(shù)：

例如：DNA及RNA的印跡轉(zhuǎn)移、核酸分子雜交、基因克隆、基因體外擴(kuò)增、DNA測(cè)序等，形成了獨(dú)特的重組DNA技術(shù)及其相關(guān)技術(shù)。

由生物化學(xué)、生物物理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物學(xué)及免疫學(xué)等各專業(yè)技術(shù)的滲透、綜合而成，并在此基礎(chǔ)上發(fā)明和創(chuàng)造了一系列新的技術(shù)。分子克隆(molecularcloning)

重組DNA(binantDNA)技術(shù)是近代分子生物學(xué)技術(shù)的核心?；虿僮?genemanipulation)

基因克隆(genecloning)基因工程(geneengineering)1.準(zhǔn)備和醞釀階段

19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代，產(chǎn)生了兩點(diǎn)對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)上的重大突破。蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA二、分子生物學(xué)的發(fā)展與應(yīng)用2.建立和發(fā)展階段

從50年代初到70年代，以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑，開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代。遺傳信息傳遞中心法則的建立對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)3.深入發(fā)展階段70年代后，以基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，標(biāo)志著人類深入認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并能改造生命的新時(shí)期開始。重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展基因組研究的發(fā)展三、分子生物學(xué)在中藥研究中的作用四、中藥研究常使的用分子生物學(xué)

技術(shù)第二章分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容：

生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能，生物大分子之間的相互作用及其與疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。核酸和蛋白質(zhì)

核酸的分子生物學(xué)主要研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能。核酸的主要作用是攜帶和傳遞遺傳信息，因此形成了分子遺傳學(xué)。一、核酸分子生物學(xué)：

分子遺傳學(xué)：形成了比較完整的理論體系和研究技術(shù)，它是目前分子生物學(xué)中內(nèi)容最豐富、研究最活躍的一個(gè)領(lǐng)域。遺傳的分子基礎(chǔ)——基因(一)基因的結(jié)構(gòu)1.基因的概念2.DNA的分子結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成3.基因的結(jié)構(gòu)(二)基因功能——復(fù)制與表達(dá)(三)基因的人工合成1、基因的概念隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展而不斷完善。從遺傳學(xué)的角度看，基因是生物的遺傳物質(zhì)，是遺傳的基本單位——突變單位、重組單位和功能單位；從分子生物學(xué)的角度看，基因是負(fù)載特定遺傳信息的DNA分子片段，在一定條件下能夠表達(dá)這種遺傳信息，變成特定的生理功能。有的生物基因?yàn)镽NA。(一)基因的結(jié)構(gòu)2、DNA的分子結(jié)構(gòu)和組成StructureofDNA脫氧核糖核酸

bpPATGCDeoxyribose單核苷酸腺嘌呤(A)鳥嘌呤(G)胞嘧啶(C)胸腺嘧啶(T)StructureofDNADNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)StructureofDNA3、基因的結(jié)構(gòu)基因：是具有生物學(xué)功能的核酸分子片段，是遺傳物質(zhì)突變、重組和具有特定遺傳功能的基本單位，是遺傳信息傳遞、表達(dá)和生物性狀形成的基礎(chǔ)。大多數(shù)真核生物基因的編碼序列不是連續(xù)排列的，被非編碼序列隔開，因此，稱為斷裂基因（splitgene）。斷裂基因

概念：真核生物的結(jié)構(gòu)基因的DNA序列由編碼序列（外顯子）和非編碼序列（內(nèi)含子）兩部分構(gòu)成，編碼序列是不連續(xù)的，被非編碼序列分隔開來，稱為斷裂基因。

組成：側(cè)翼序列：?jiǎn)?dòng)子，增強(qiáng)子，終止子編碼序列：內(nèi)含子，外顯子(GT-AG)真核基因結(jié)構(gòu)模式圖啟動(dòng)子增強(qiáng)子終止子RNA蛋白質(zhì)復(fù)制翻譯轉(zhuǎn)錄DNA逆轉(zhuǎn)錄（二）、基因的復(fù)制和表達(dá)中心法則的建立1958年，Crick提出了分子生物學(xué)的中心法則（centraldogma）。

中心法則是分子遺傳學(xué)基本理論體系。

DNA復(fù)制的特點(diǎn)1、多起點(diǎn)、非同步、雙向復(fù)制：2、半保留復(fù)制（Semi–conservativereplication）3、半不連續(xù)復(fù)制（Semi–discontinuousreplication）：5’→3’，RNA作為引物1、DNA的復(fù)制（DNAReplication）Semi–conservativereplicationSemi–discontinuousreplication基因表達(dá)基因表達(dá)指基因組中某基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為mRNA和翻譯成蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_(dá)的改變預(yù)示著細(xì)胞在分子水平上的變化。它往往是細(xì)胞形態(tài)功能變化之前的變化。DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄翻譯2.DNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(Transcription)從基因上游的啟動(dòng)子處開始轉(zhuǎn)錄以DNA雙鏈中3’在上游的單鏈（反義鏈）為模板原始轉(zhuǎn)錄本稱為異質(zhì)核RNA(hnRNA)，含有全部?jī)?nèi)含子和5’與3’部分非翻譯區(qū)原始轉(zhuǎn)錄本通過不同加工方式形成多種指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄本mRNA的轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶II催化,rRNA由RNA聚合酶I催化,tRNA由RNA聚合酶III催化異質(zhì)核RNA的加工1、剪接(Splicing):剪掉內(nèi)含子，拼接外顯子，被剪內(nèi)含子的序列為GU----AG2、戴帽(Capping):在5’端連接一個(gè)7甲基鳥苷酸，免受RNA酶消化；利于RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)；便于剪接；有助于核糖體識(shí)別。3、加尾(Tailing):在3’端加PolyA(~200mer)。加尾信號(hào)為AAUAAA，加尾點(diǎn)位于信號(hào)下游幾十個(gè)核苷酸后。利于RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)；有助于核糖體識(shí)別；穩(wěn)定RNA。3.翻譯在細(xì)胞質(zhì)中，以mRNA為模板，tRNA為運(yùn)載工具，將活化氨基酸在核糖體上裝配成多肽鏈的過程，多肽鏈經(jīng)過修飾加工成為有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。人類基因表達(dá)調(diào)控：1、轉(zhuǎn)錄前調(diào)控：組蛋白與DNA結(jié)合后，可以抑制基因表達(dá)。非組蛋白可以解除組蛋白對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄的抑制，促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄，是轉(zhuǎn)錄前調(diào)控的重要方式。2、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：是人類基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵，可以通過啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等特異序列與相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合激活或抑制轉(zhuǎn)錄過程而到達(dá)調(diào)控基因表達(dá)的目的。3、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控：主要是初級(jí)RNA加工過程受到調(diào)控。通過不同的加工可以由一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生出不同的成熟mRNA，從而翻譯出不同的蛋白質(zhì)。4、翻譯水平調(diào)控：核糖體數(shù)量、mRNA的成熟度、啟動(dòng)因子、延伸因子、釋放因子和各種酶等均能影響蛋白質(zhì)合成。5、翻譯后調(diào)控：多肽鏈合成后要通過修飾、加工，才能成為具有一定生物活性的蛋白質(zhì)。1978年體外首次成功地人工合成第一個(gè)完整基因。直接證實(shí)了MendelG在1865年發(fā)現(xiàn)的遺傳因子(基因)的化學(xué)本質(zhì)，就是DNA分子。

DNA分子是多種多樣生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)。（三）.基因的人工合成二、蛋白質(zhì)分子生物學(xué)：

DNA→儲(chǔ)存生命活動(dòng)的各種信息。

蛋白質(zhì)→生命活動(dòng)的執(zhí)行者。蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)主要研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展

1956年，Anfinsen和White根據(jù)對(duì)酶蛋白的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)，提出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)是由其氨基酸序列來確定的。1958年，Ingram證明正常的血紅蛋白與鐮狀細(xì)胞溶血癥病人的血紅蛋白之間，在其亞基的肽鏈上僅有一個(gè)氨基酸殘基的差別。1969年，Weber開始應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量；20世紀(jì)60年代先后分析了血紅蛋白、核糖核酸酶A等一批蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

中國(guó)科學(xué)家在1965年人工合成了牛胰島素；1973年又用1.8AX射線衍射分析法測(cè)定了牛胰島素的空間結(jié)構(gòu)。謝謝！生物技術(shù)的定義：

按照美國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)組織下的定義，生物技術(shù)(biotechnology)是指“利用細(xì)胞和分子過程來解決問題或制造產(chǎn)品的技術(shù)”。分子生物學(xué)技術(shù)古代生物技術(shù)

釀酒、制醋、制酪、面包發(fā)酵；人畜排泄物循環(huán)利用；動(dòng)、植物雜交育種，嫁接等。

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