咔唑比色法測定果膠物質(zhì)含量一、目的要求學習咔唑比色法測定果蔬組織中果膠含量的原理和方法。二、基本原理果膠物質(zhì)（Pectin），即多聚半乳糖醛酸（Polygalacturonicacid）是一種植物膠，主要是由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵連接形成的直鏈狀聚合物，部分D-半乳糖醛酸上的羧基被甲醇酯化而形成甲酯。果實細胞初生壁和中膠層中沉積著大量的果膠物質(zhì)，起著粘結(jié)細胞個體的作用。在未成熟果實中，果膠物質(zhì)與纖維素結(jié)合以原果膠的形式存在。原果膠是一種非水溶性的物質(zhì)，它的存在使果實顯得堅實、脆硬。隨著果實的成熟，果膠物質(zhì)逐漸與纖維素分離形成易溶于水的果膠，果實組織也變得松弛、軟化，硬度下降。果膠物質(zhì)水解生成半乳糖醛酸，在硫酸溶液中能與咔唑試劑進行縮合反應，形成紫紅色的化合物，該化合物呈色強度與半乳糖醛酸溶液濃度成正比，故可通過比色法定量測定。該化合物顏色在反應1~2h呈現(xiàn)最深，然后開始退色。當顏色最深時在530nm波長出測定消光值，然后從標準曲線中計算樣品果膠含量。三、材料、儀器及試劑（一）材料柑橘、蘋果、山楂。（二）儀器及用具分光光度計、天平、研缽、容量瓶（100mL）、具塞刻度試管（25mL）、移液器、三角瓶（100mL）、水浴鍋、計時器、離心機（8000r/min），50mL刻度離心管。（三）試劑1．0.15%咔唑稱取0.15g咔唑加入無水乙醇溶解并稀釋至100mL；2．100μg/mL半乳糖醛酸標準液稱取10mg半乳糖醛酸（分子量為194），用蒸餾水溶解、定容至100mL。3．濃硫酸（分析純）4．95%乙醇5．0.5mol/L硫酸三、實驗步驟（一）標準曲線制作取6支25mL具塞刻度試管，編號，按照表15加入半乳糖醛酸標準液，然后小心地沿管壁加入6.0mL濃硫酸，在沸水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫后，各加入0.2mL0.15%咔唑-乙醇溶液，搖勻。在暗處放置30min后，測定反應液在波長530nm處的吸光度值。以半乳糖醛酸微克數(shù)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，求得線性回歸方程。表15.繪制半乳糖醛酸標準曲線各試劑加入量項目管號012345半乳糖醛酸標準液/mL00.20.40.60.81.0蒸餾水/mL1.00.80.60.40.20相當于半乳糖醛酸量/μg020406080100（二）提取1．可溶性果膠的提取稱取1.0g果蔬組織樣品，置于研缽中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入到50mL刻度離心管中，加入25mL95%乙醇，在沸水浴上加熱30min，以除去樣品中糖分及其它物質(zhì)。注意在煮沸過程中要及時補加95%乙醇溶液。取出冷卻至室溫后，于8000r/min離心15min，棄去上清液。再加入95%乙醇，在沸水浴上加熱。如此重復3~5次。然后將沉淀放入原試管中，加入20mL蒸餾水，在50℃水浴中保溫30min，以溶解果膠。取出冷卻至室溫后，于8000r/min離心15min，將上清液移入100mL容量瓶中，用少量水洗滌沉淀，離心后，一并將上清液移入到容量瓶中，加蒸餾水至刻度，此溶液即為可溶性果膠。2．原果膠的提取經(jīng)蒸餾水洗滌后的沉淀物，仍保留在原刻度離心管中。再向離心管中加入25mL0.5mol/L硫酸溶液，在沸水浴中加熱1h以水解原果膠。取出冷卻至室溫后，于8000r/min離心15min，將上清液移入100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，此為原果膠測定液。（三）測定吸取1.0mL提取液，加入到25mL刻度試管中，按標準曲線的操作步驟進行測定。重復三次。五、實驗結(jié)果與計算1．將測定的數(shù)據(jù)填入下表重復次數(shù)樣品重量W(g)提取液總體積V(mL)吸取樣品液體積Vs(mL)530nm吸光度值由標曲查得的半乳糖醛酸量C(μg)樣品中果膠物質(zhì)含量(%)計算值平均值±標準偏差SPPPSPPPSPPPSPPPSPPPSPPP123注：SP-可溶性果膠，PP-原果膠2．計算結(jié)果根據(jù)溶液吸光度值，在標準曲線上查出相應的半乳糖醛酸微克數(shù)，計算果蔬組織中果膠含量，以生成半乳糖醛酸的百分含量表示。計算公式：果膠（%）=原果膠（%）+可溶性果膠（%）式中：C——從標準曲線查得半乳糖醛酸量，μg；V——樣品提取液總體積，mL；Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；W——樣品重量，g。分別按上述公式計算原果膠與可溶性果膠含量。提取液總體積按各自最后定容的體積計算。六、注意事項1．硫酸的純度對咔唑的呈色反應有很大的影響，故必須用分析純的硫酸。2．在加入95%乙醇溶液后的幾次煮沸過程中，都會造成試管中溶液的揮發(fā)損失。在操作過程中，應注意隨時觀察，及時補加乙醇溶液。3．一定要用利用乙醇進行多次蒸煮以完全除去樣品中的糖分及其它雜質(zhì)。否則，樣品提取液中殘留的糖在加入濃硫酸和咔唑溶液后會形成其它呈色化合物，嚴重影響正常測定。提取液中是否含糖可用糖分的穆立虛反應法檢驗。方法是：取0.5mL提取液置于小試管中，加入2~3滴5%α-萘酚的乙醇溶液，充分混合，此時溶液稍有白色沉淀。然后，使試管稍稍頃斜，用吸管沿管壁緩緩加入1mL濃硫酸（注意水層與硫酸層不可混合）。待試管靜置后，若在兩液層的界面產(chǎn)生紫紅色色環(huán)，則證明提取液中含有糖分，仍繼續(xù)進行脫糖操作。4．當果膠含量較高時，應對提取液進行稀釋后在進行測定。5．此外，還可通過以下方法測定果膠含量：取1.0mL提取液置于25mL的刻度試管中，加入0.2