關(guān)于免疫標(biāo)記技術(shù)第一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日根據(jù)抗原抗體結(jié)合的特異性和標(biāo)記分子的敏感性建立的技術(shù)，稱免疫標(biāo)記技術(shù)。(

immunolabellingtechnique)第二頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日

高敏感性的標(biāo)記分子主要有熒光素、酶、放射性同位素，由此建立了免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和放射免疫分析等技術(shù)。特點(diǎn)：敏感性高、特異性強(qiáng)應(yīng)用：微生物鑒定、傳染病診斷、生物活性物質(zhì)的測(cè)定、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。第三頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)免疫熒光抗體技術(shù)Immunofluorescenceantibodytechnique

指用熒光素對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，然后用熒光顯微鏡觀察熒光，以分析示蹤相應(yīng)的抗原或抗體的方法。Coons等1941年建立該技術(shù)，當(dāng)時(shí)用熒光黃標(biāo)記，但效果不好，故不能推廣。第四頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日

當(dāng)發(fā)現(xiàn)異硫氰酸熒光素（FITC）被發(fā)現(xiàn)后，以及熒光抗體純化技術(shù)的發(fā)展，顯著提高了熒光抗體技術(shù)的敏感性和特異性，故得到廣泛應(yīng)用。用于病原檢測(cè)、疫病診斷等第五頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日1原理：熒光素在超微濃度下，亦能被短波長(zhǎng)光激發(fā)，在熒光顯微鏡下可觀察到熒光。是將抗原抗體反應(yīng)的特異性、熒光檢測(cè)的敏感性以及顯微鏡技術(shù)的精確性等相互結(jié)合的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。第六頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日2熒光素為一種化學(xué)染料。常用于標(biāo)記的熒光素有：異硫氰酸熒光素（FITC）、四乙基羅丹明（RB200）、四甲基異硫氰酸羅丹明，其中FITC最常用。第七頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日作為標(biāo)記熒光素需滿足的條件：（1）有與蛋白分子形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)，且不形成有害產(chǎn)物。（2）熒光效率高，與蛋白結(jié)合的需要量小。（3）標(biāo)記后不影響抗體的活性（4）性質(zhì)穩(wěn)定，易保存（5）激發(fā)的熒光與背景顏色有良好的反差。（6）標(biāo)記簡(jiǎn)單，能形成商品第八頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日3熒光抗體染色方法（1）標(biāo)本制備涂片或亞印片：細(xì)菌培養(yǎng)物、感染動(dòng)物的組織、血液、膿汁切片：感染組織蓋玻片：上面培養(yǎng)單層細(xì)胞標(biāo)本要求很薄，并要保持抗原的完整性第九頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（2）固定常用丙酮和95%乙醇，室溫固定15~30min，后用PBS反復(fù)沖洗，干后即可染色。固定目的：防止被檢材料從玻片上脫落；消除標(biāo)本內(nèi)抑制抗原抗體反應(yīng)的因素；檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的抗原，用有機(jī)溶劑固定，有利于熒光抗體滲入。第十頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（3）染色方法

有直接法和間接法兩種直接法：A在標(biāo)本上滴加2~4個(gè)單位的標(biāo)記抗體，置濕盒中，37℃作用30minB在大量PBS中漂洗15min，第十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日C干燥D封載滴加緩沖甘油，用蓋玻片封蓋檢測(cè)中，要設(shè)陽(yáng)性、陰性標(biāo)本對(duì)照緩沖甘油：分析純甘油9份加PBS1份第十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日直接法豬鏈球菌2型MRP的鑒定A豬鏈球菌2型肉湯培養(yǎng)物涂片，涼干BPBS漂洗5minC加入FITC標(biāo)記的抗MRP抗體，置濕盒中，37℃作用30minDPBS漂洗5minE干燥、封載第十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日?qǐng)D2AMRP單抗介導(dǎo)FITC標(biāo)記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像圖2BSS2多抗介導(dǎo)FITC標(biāo)記的SS2的激光共聚焦圖像AB第十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日A在標(biāo)本上滴加抗SFV血清，置濕盒中，37℃作用30minBPBS漂洗5minC加FITC標(biāo)記的抗抗體，置濕盒中，37℃作用30minDPBS漂洗E干燥、封載間接法（如檢測(cè)豬淋巴結(jié)中的SFV）第十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日4熒光顯微鏡觀察第十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（1）細(xì)菌學(xué)診斷可直接檢測(cè)或鑒定新分離的細(xì)菌，具有較高的敏感性和特異性。動(dòng)物糞便、黏膜拭子涂片、病變組織觸片或切片、尿沉渣等均可作為樣本對(duì)含菌少的樣本，可采用濾膜聚菌法，然后在濾膜上進(jìn)行免疫熒光染色5免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用第十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（2）病毒病診斷直接檢測(cè)病變組織中的病毒，是病毒病診斷的常用手段。如豬瘟、雞傳支豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎，臨床癥狀相似，但將豬小腸做切片，即可區(qū)分對(duì)于豬瘟等不出現(xiàn)細(xì)胞病變的病毒，免疫熒光可作為病毒增殖的指征第十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（3）其他應(yīng)用

免疫熒光廣泛應(yīng)用于淋巴細(xì)胞CD分子和膜表面免疫球蛋白的檢測(cè)，用于淋巴細(xì)胞的分型；借助于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)，可以評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫狀況。如佐劑刺激機(jī)體細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，可通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞上的CD表達(dá)量來(lái)證實(shí)第十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)免疫酶標(biāo)記技術(shù)

是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化反應(yīng)的高敏感性而建立的免疫檢測(cè)技術(shù)。1966年，Nakane報(bào)道用酶代替熒光素標(biāo)記抗體，建立酶標(biāo)記抗體技術(shù)，用于組織中抗原的定位。

第二十頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日1971年，Engvall報(bào)道酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，建立免疫酶定量檢測(cè)技術(shù)。1980年后，建立了檢測(cè)和鑒定蛋白質(zhì)的免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)。第二十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日一、原理

酶是有機(jī)催化劑，微量的酶可催化大量的化學(xué)反應(yīng)，如果產(chǎn)物為有色可見(jiàn)物，則極為敏感。

E+S(ES)E+P

如果產(chǎn)物沒(méi)有顏色，則可通過(guò)供氫體顯色，來(lái)顯示反應(yīng)的發(fā)生。E+S(ES)，(ES)+D1E+P+D2

第二十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日

D1為供氫體，無(wú)色，底物水解時(shí)，D1由還原型變?yōu)檠趸虳2，呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。第二十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日基本程序1酶分子與抗原或抗體分子共價(jià)結(jié)合2酶標(biāo)抗體或抗抗體與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異結(jié)合，并洗下未結(jié)合的物質(zhì)。3滴加底物溶液，底物在酶作用下顯色；或底物不顯色，但在底物水解過(guò)程中，由另外的供氫第二十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日體提供氫離子，使供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。4根據(jù)顏色變化判斷反應(yīng)的發(fā)生。第二十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日二、用于標(biāo)記的酶標(biāo)記酶應(yīng)具有的特征：1高度的特異活性和敏感性；2在室溫下穩(wěn)定；3易于獲得并能商品化生產(chǎn)；4與底物反應(yīng)的產(chǎn)物易于顯現(xiàn)第二十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（一）辣根過(guò)氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，稱（horseradishperoxidase,HRP)。。

其作用底物為過(guò)氧化氫，催化時(shí)需要供氫體。供氫體主要有：鄰苯二胺（OPD）、聯(lián)苯二胺（DAB）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）第二十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日OPD的氧化產(chǎn)物可溶解于水，呈橙色，最大吸收波長(zhǎng)為490nmTMB產(chǎn)物溶于水，呈蘭色，加氫氟酸終止反應(yīng)，在650nm測(cè)定；用硫酸終止，呈黃色，450nm下測(cè)定DAB的氧化產(chǎn)物不溶于水，呈黃褐色第二十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（二）堿性磷酸酶（AKP）從牛小腸黏膜和大腸桿菌中提取底物常用對(duì)硝基苯磷酸鹽，酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶解，最大吸收波長(zhǎng)400nm。第二十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日三、常用的免疫酶標(biāo)記技術(shù)（一）免疫組織化學(xué)染色1標(biāo)本制備與免疫熒光相同2標(biāo)本處理用1%~3%的H2O2甲醇處理標(biāo)本，低溫條件下，作用10~15分鐘，可同時(shí)起到固定和消除內(nèi)源酶的作用。第三十頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日3封閉10%卵白蛋白（OVA）或0.05%Tween-80和含有1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS對(duì)標(biāo)本處理30min，能消除背景顏色。4染色方法可采用直接法、間接法等，與免疫熒光方法相似。第三十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（二）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)

將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果。1載體聚苯乙烯微量滴定板最常用，有96孔、40孔以及酶標(biāo)條。第三十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日2包被將抗原或抗體吸附于固相表面的過(guò)程。大多數(shù)抗原易吸附在表面。用碳酸鹽緩沖液包被，4℃過(guò)夜或37℃吸附2~3h。3洗滌用含0.05%Tween-80的PBS第三十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日4實(shí)驗(yàn)方法直接法用于測(cè)抗原（如沙門氏菌）（1）待檢抗原包被（2）洗滌3~5次，每次3~5min（3）封閉含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度為10mmol）（4）洗滌同上（5）加酶標(biāo)記的抗沙門氏菌的單抗，置濕盒中，37℃作用1~2h（6）洗滌同上（7）加底物顯色，測(cè)OD值第三十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日間接法：用于測(cè)抗體（如測(cè)AIV抗體）（1）AIV病毒包被（2）洗滌3~5次，每次3~5min（3）封閉含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度為10mmol）（4）洗滌同上（5）加待檢抗體，置濕盒中，37℃作用1~2h（6）洗滌同上（7）加酶標(biāo)記抗抗體，置濕盒中，37℃作用1~2h（8）加底物顯色，測(cè)OD值第三十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日夾心法（又稱雙抗體法，用于測(cè)抗原）（1）抗AIV多抗包被（2）洗滌3~5次，每次3~5min（3）封閉含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度為10mmol）（4）洗滌同上（5）加待檢抗原，置濕盒中，37℃作用1~2h（6）洗滌同上（7）加酶標(biāo)記抗AIV單抗，置濕盒中，37℃作用1~2h（8）加底物顯色，測(cè)OD值第三十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日雙抗體夾心法

（1）抗AIV多抗包被（2）洗滌3~5次，每次3~5min（3）封閉含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度為10mmol）（4）洗滌同上（5）加待檢抗原，置濕盒中，37℃作用1~2h第三十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（6）洗滌同上（7）加抗AIV單抗，置濕盒中，37℃作用1~2h（8）洗滌同上（9）加酶標(biāo)記抗AIV單抗，置濕盒中，37℃作用1~2h（10）洗滌，加底物顯色，測(cè)OD值第三十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)果判定：P/N≥2.1判為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)中，要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先用空白對(duì)照孔調(diào)零。第三十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日其他ELISA技術(shù)1阻斷ELISA2酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法3酶標(biāo)抗體直接競(jìng)爭(zhēng)法4SPA-ELISA5Dot-ELISA第四十頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)放射免疫分析

Radioimmunoassay(RIA)是將放射性同位素測(cè)量的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)而建立的一種免疫分析技術(shù)。

第四十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日1959年Yalow和Berson共同建立了該技術(shù)，可精確地測(cè)定體液中微量活性物質(zhì)的量。1977年獲諾貝爾獎(jiǎng)。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。第四十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日一、原理

放射性同位素核衰變時(shí)，會(huì)發(fā)出α、β、γ射線，或從核外俘獲一個(gè)正電子。各種射線均可用儀器檢測(cè)，且靈敏度很高。3H放出β射線，能量低，用液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)；32P、35S放出中等能量的β射線，125I放出γ射線，均可用井型計(jì)數(shù)器檢測(cè)。第四十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日1競(jìng)爭(zhēng)性RIA原理定量分析微量半抗原物質(zhì)均采用該法。同時(shí)在溶液中加入標(biāo)記抗原（*Ag）、非標(biāo)記抗原（Ag）和抗體（Ab），使*Ag與Ag競(jìng)爭(zhēng)性地與Ab結(jié)合，根據(jù)免疫沉淀物中，*Ag.Ab的減少來(lái)測(cè)定Ag的量。第四十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日*Ag+Ab*Ag-Ab+Ag

Ag-Ab

當(dāng)反應(yīng)體系中存在一定量的*Ag和Ab時(shí)，結(jié)合型*Ag-Ab(B)和游離型*Ag（F）的比例是一定的，他們保持著可逆的動(dòng)態(tài)平衡。第四十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日

在此反應(yīng)液中加入待檢的Ag，則Ag與*Ag競(jìng)爭(zhēng)地與Ab結(jié)合，Ag的量越多，B/F的比值或B%越小。因此，只要把反應(yīng)液中的B和F分開(kāi)，然后分別測(cè)定B和F的放射性，即可計(jì)算出B/F值和結(jié)合百分率（B%）。第四十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日

用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物（Ag）和一定量的*Ag、Ab反應(yīng)，測(cè)出不同濃度Ag下的B/F，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，以B/F為縱坐標(biāo)，即可繪制競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)曲線。實(shí)驗(yàn)中，測(cè)出待檢抗原的B/F，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其含量。第四十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日2固相夾心RIA

與夾心ELISA的原理相似，以一定量的抗體包被反應(yīng)管，然后加入系列稀釋的待檢抗原，最后加入放射性同位素標(biāo)記的抗體，計(jì)數(shù)結(jié)果。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測(cè)定。其只能檢測(cè)完全抗原。第四十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日3放射免疫檢測(cè)與免疫酶組織化學(xué)染色法的原理相似。用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，加入到組織制片或固定檢樣上，用放射自顯影以顯示組織或固定檢樣中相應(yīng)的抗原或抗體的位置?？蛇M(jìn)行定性和定位檢測(cè)。第四十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日二標(biāo)記用的同位素作為標(biāo)記用的同位素需滿足以下條件：1為低序號(hào)的常見(jiàn)元素2放射強(qiáng)度低或中等3半衰期適中（既能保證檢測(cè)時(shí)間，又便于環(huán)境處理）。第五十頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日三、常用放射免疫分析技術(shù)（一）液相放射免疫測(cè)定放免通常指液相法1試驗(yàn)基本過(guò)程：（1）適量處理待測(cè)樣品（2）按一定要求加樣，