胸腔取出心臟上方的胸腺，用5%-NBS-Hanks液清洗，剝離其它組織，移入另一干凈平皿內(nèi)，用剪刀將胸腺剪碎，加入少量5%-NBS-Hanks液，用毛細(xì)滴管吹打胸腺碎塊以產(chǎn)生更多的游離細(xì)胞，用單層尼龍紗布過濾，即得胸腺細(xì)胞懸液。用5%-NBS-Hanks液洗胸腺細(xì)胞2次，離心1000r/min。洗后用RPMI1640培養(yǎng)液將胸腺細(xì)胞配成 1X106/ml懸液。2．細(xì)胞培養(yǎng)：于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板A、B、C三排的第1?9孔分別加入1/1、1/2、1/4……1/256用RPMI1640培養(yǎng)液作倍比稀釋的IL2待檢樣品0.1ml。于A、B、C三排的第10孔加入1/2待檢樣品0.1ml，于第11孔與12孔各加入RPMI1640培養(yǎng)液0.1ml。與D、E、F三排的第1?6孔分別加入1/8……1/256用RPMI1640培養(yǎng)液作倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)IL2樣品0.1ml，于第7孔加1/8IL2稀釋液0.1ml。A?F排所有孔加入小鼠胸腺細(xì)胞懸液 A?F排所有孔加入小鼠胸腺細(xì)胞懸液 0.1ml(1X105細(xì)胞)。A、B、C三排的第12孔外，其它所有孔加入 20卩g/ml的ConA溶液20卩I。37C5%CO2孵箱培養(yǎng)66h，每孔加入3H-TdR20卩I(0.2卩ci)后，繼續(xù)培養(yǎng)6(5)(6)h。用多道細(xì)胞收獲器將各孔細(xì)胞收集于玻璃濾紙上，干燥后用液體閃爍計數(shù)器測量摻(7)用多道細(xì)胞收獲器將各孔細(xì)胞收集于玻璃濾紙上，干燥后用液體閃爍計數(shù)器測量摻入細(xì)胞的3H-TdRcpm值。用IL2依賴細(xì)胞株測定IL2活性【原理】人或小鼠的IL2依賴細(xì)胞株，如CTLL等，依賴培養(yǎng)液中含有IL2才能不斷增殖，若用不含【原理】人或小鼠的IL2依賴細(xì)胞株，如CTLL等，依賴培養(yǎng)液中含有IL2才能不斷增殖，若用不含IL2的相同的培養(yǎng)液培養(yǎng)，則在 24h內(nèi)停止DNA合成和增殖。據(jù)此特性，可將 IL2依賴細(xì)胞株作為指示細(xì)胞，測定待測樣品中【材料】IL2依賴細(xì)胞株CTLLRPMI1640培養(yǎng)液待測IL2樣品標(biāo)準(zhǔn)IL2樣品96孔平底培養(yǎng)板3H-TdR摻入所用儀器，【方法】1．IL2活性?？寺』腡淋巴細(xì)胞株)試劑同前2．將標(biāo)準(zhǔn)和待測IL2孔平底培養(yǎng)板，每孔0.1ml。同時做不含樣品的對照孔。用不含IL2的培養(yǎng)液將CTLL細(xì)胞株細(xì)胞洗2次，配成105/ml細(xì)胞數(shù)，每孔加0.1ml細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板放入37C5%CO2培養(yǎng)箱，經(jīng)18?24h后，各孔加3H-TdR20卩l(xiāng)，使每孔最樣品用1640培養(yǎng)液倍比稀釋1/2、1/4……1/256,一式三份加入96終濃度為1卩終濃度為1卩ci/ml，繼續(xù)培養(yǎng)5h后，細(xì)胞檢測IL2的方法相同?！窘Y(jié)果】IL2單位的計算，與用小鼠胸腺細(xì)胞檢測將標(biāo)準(zhǔn)和待測IL2樣品各稀釋三個復(fù)孔的別得出各稀釋度實際摻入值。以標(biāo)準(zhǔn) IL2用細(xì)胞收獲器收獲細(xì)胞，以后過程與小鼠胸腺IL2的方法相同。cpm值，減去僅加ConA對照孔的cpm均值分樣品最高濃度所測得得最高實際cpm值為最大摻入值，計算出標(biāo)準(zhǔn)及待檢樣品各稀釋度摻入的百分率，按公式計算：各稀釋度實際摻入值 %最大實際摻入值100%然后以各稀釋度為橫坐標(biāo)，摻入百分率為縱坐標(biāo)，在正態(tài)概率紙上繪制兩者關(guān)系的曲線。引起50%摻入百分率所需要的IL2稀釋度，稱為1個IL2活性單位。若與已知單位的IL2標(biāo)準(zhǔn)品比較，可計算出待測樣品的標(biāo)準(zhǔn)單位數(shù)。例：IL2標(biāo)準(zhǔn)品已知為50單位/ml，本試驗測得50%摻入百分率得稀釋度為 1:1,待測樣品50%摻入百分率的稀釋度為 1:2,其含IL2的標(biāo)準(zhǔn)單位數(shù)可按下式計算。IL2單位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品IL2單位數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)品單位/ml待測樣品50%摻入率的稀釋度1、、—250單位/ml10單位/ml10實驗十九、B細(xì)胞膜表面免疫球蛋白（SmIg）的檢查——直接免疫熒光法(DirectImmunoflurescentmethodforBCellSmIg)【原理】SmIg是B細(xì)胞的抗原識別受體，也是B細(xì)胞特異的表面標(biāo)志，用直接免疫熒光法可檢查出SmIg。用熒光素標(biāo)記的抗Ig抗體，在一定條件下與淋巴細(xì)胞混合，熒光素標(biāo)記的抗Ig抗體可以與B細(xì)胞表面的Ig結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察可見B細(xì)胞膜上出現(xiàn)熒光?！静牧稀慨惲蚯锜晒馑兀‵ITC）標(biāo)記的兔抗人IgG抗體（或IgM，IgA）pH7.4Hanks液（內(nèi)含0.1%NaN3）TGL-TGB臺式離心機(jī)1ml椎形塑料離心管【方法】1．經(jīng)分層液分離的淋巴細(xì)胞，用0.1%NaN3-Hanks液洗1次，作細(xì)胞計數(shù)，配成1x106/ml1．2．取小椎形離心管二支，每支加入1x106/ml細(xì)胞懸液1ml，置臺式離心機(jī)離心2000r/min,3min去除上清液，加入熒光素標(biāo)記的兔抗人IgG（或IgM,IgA）抗體50卩I,放置4C冰箱30min2．3．取出椎形管，用含0.1%NaN3-Hanks液洗細(xì)胞23．【結(jié)果】在熒光顯微鏡下觀察，落射激光下SmIg陽性細(xì)胞呈環(huán)狀或斑點狀熒光，用鎢絲燈光源透射光照明計數(shù)同一視野淋巴細(xì)胞總數(shù)，共計 200?300個淋巴細(xì)胞，算出其中SmIg陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。問題：免疫熒光法的應(yīng)用范圍是什么？常用的熒光素有哪幾種？

實驗二十、EA玫瑰花環(huán)實驗(EARosettetest)【原理】B細(xì)胞表面具有IgG的Fc受體，用IgG致敏的雞紅細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合后在一定條件下，IgG的Fc段與B細(xì)胞的Fc受體結(jié)合而使IgG致敏的雞紅細(xì)胞圍繞B細(xì)胞形成玫瑰花環(huán)?！静牧稀?%雞紅細(xì)胞1:5000稀釋的兔抗雞紅細(xì)胞IgG(稍低于凝集效價)Hanks液【方法】1．致敏雞紅細(xì)胞：4%雞紅細(xì)胞5ml加入1:5000稀釋的兔抗雞紅細(xì)胞IgG，混合后置室溫30min，用Hanks液洗2次，恢復(fù)5ml體積即4%致敏雞紅細(xì)胞。2.經(jīng)分層液分離的淋巴細(xì)胞0.1ml，相當(dāng)于1X106個細(xì)胞數(shù)，加入4%致敏雞紅細(xì)胞0.1ml，混勻，放37C孵育5min,1000r/min，離心5min，放室溫20min后重新懸浮，取一滴置載玻片上，蓋上加過瑞氏染液 2滴的蓋玻片放置5min，鏡下計數(shù)?！窘Y(jié)果】高倍鏡下計數(shù)200個淋巴細(xì)胞結(jié)合3個以上有核雞紅細(xì)胞者即為Fc受體陽性細(xì)胞。計算出Fc受體陽性淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞數(shù)的百分比，正常值為 21.35±5.9%。注意計數(shù)B細(xì)胞Fc受體陽性率時，應(yīng)除外帶有Fc受體的非淋巴細(xì)胞，如單核細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞?？筛鶕?jù)細(xì)胞大小，形態(tài)加以區(qū)分。問題：哪些細(xì)胞可以形成EA花環(huán)？實驗EA花環(huán)實驗和E花環(huán)實驗的區(qū)別是什么？實驗、EAC玫瑰花環(huán)實驗(EACRosettetest)【原理】B淋巴細(xì)胞表面帶有補(bǔ)體(C3)的受體，用IgM抗體致敏紅細(xì)胞，再與補(bǔ)體結(jié)合，形成B淋巴細(xì)胞借其表面的補(bǔ)形成EAC花環(huán)。用此方法可檢查血液中帶補(bǔ)體受體的B淋巴紅細(xì)胞-IgM抗體-補(bǔ)體復(fù)合物即EAC，然后再與淋巴細(xì)胞混合，體將EAC吸附在其周圍，細(xì)胞數(shù)目?！静牧稀?%雞紅細(xì)胞1:4000兔抗雞紅細(xì)胞抗體1:100豚鼠補(bǔ)體淋巴細(xì)胞懸液Hanks液【方法】1．EAC細(xì)胞懸液制備：溫下作用30min，離心棄上清，用Hanks液洗2次，恢復(fù)4%雞紅細(xì)胞1ml。加入等體積1:100豚鼠新鮮血清即補(bǔ)體，混勻后放37C溫箱30min，用Hanks液洗2次，加入1mlHanks液，即成4%EAC細(xì)胞懸液。2.經(jīng)分層液分離的淋巴細(xì)胞 0.1ml（含105細(xì)胞數(shù)），加入4%EAC細(xì)胞懸液0.1ml，混勻，室溫下作用30min離心1000r/min，上，蓋上已滴加過瑞氏染液的蓋玻片，放置【結(jié)果】高倍鏡下計數(shù)200個淋巴細(xì)胞，細(xì)胞表面吸附值：13±1%。注意，根據(jù)細(xì)胞大小、形態(tài)等排除單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等的干擾，因這些細(xì)胞表面亦有補(bǔ)體受體。問題：哪些細(xì)胞能形成EAC花環(huán)？常用于檢測何種細(xì)胞？應(yīng)用價值如何？稍低于溶血效價）4%雞紅細(xì)胞1ml加入1:4000稀釋的兔抗雞抗體1ml混勻，室5min。將細(xì)胞重新懸浮，取1滴置載玻片5min，顯微鏡下計數(shù)。3個以上有核雞紅細(xì)胞者即為陽性，正常實驗二十二、體外抗體形成細(xì)胞（PlaqueFormingCell，PEC）檢查法【原理】PFC測定技術(shù)又稱溶血空斑試驗。是一種體外檢測抗體形成細(xì)胞的方法。將一定量洗滌過的綿羊紅細(xì)胞腹腔注射小鼠，4天后將小鼠殺死，取脾臟制成脾細(xì)胞懸液，內(nèi)含抗體形成細(xì)胞（PFC）。然后，將脾細(xì)胞、綿羊紅細(xì)胞、補(bǔ)體混合孵育，由于 PEC所分泌的抗體和綿羊紅細(xì)胞（抗原）結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合體，給補(bǔ)體作用面形成肉眼可見的溶血空斑。本實驗可作為機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)，研究藥物對機(jī)體免疫功能的影響等特異指標(biāo)。具有特異性高，篩檢力強(qiáng)，可直接觀察等特點。PFC檢查法目前所用的方法有：瓊脂固相法、單層細(xì)胞法、小室液相法本次實驗介紹小室液相法?！静牧稀拷馄势鞑脑嚬?、1ml吸管、毛細(xì)滴管載玻片、用雙面膠條制成的小室石蠟盤、酒精燈微量加樣器及槍頭小鼠5%和15%綿羊紅細(xì)胞（SRBC）豚鼠新鮮血清——補(bǔ)體（經(jīng)SRBC吸收過）含6%新生牛血清的Hanks液【方法】1．免疫小鼠及脾細(xì)胞懸液的制備：用 5%SRBC0.4ml（約4X1061．4天后拉脫頸椎處死，取出脾臟放在已加入6mlHanks液的平皿中，用100目的不銹鋼網(wǎng)研磨后，經(jīng)尼龍布過濾放入試管中，離心 1000r/min,5min，洗2次。將沉淀的脾細(xì)胞重懸Hanks液中，細(xì)胞計數(shù)配成1x107/ml細(xì)胞濃度。2．3．補(bǔ)體制備：新鮮豚鼠血清，經(jīng)綿羊紅細(xì)胞吸收后，用 Hanks液配成1:62．3．綿羊紅細(xì)胞（SRBC）:取脫纖維SRBC,用生理鹽水洗3次，（每次1500r/min,10min）最后一次要2500r/min15min，取壓積SRBC配成10%的SRBC懸液。4.取1x107/ml脾細(xì)胞100卩1,5%SRBC200卩1,1:6?1:8補(bǔ)體200卩I,Hanks液1000卩l(xiāng)，混勻，用微量加樣器將混合液注入事先制備好的小室中（每小室 100卩l(xiāng)）,然后以石蠟封口，放37C溫箱1.5h,取出觀察結(jié)果。106106個脾細(xì)胞所含空斑數(shù)。1．21．2．3.放37C溫箱培養(yǎng)時必須放平，不可傾斜。問題：PFC實質(zhì)是什么細(xì)胞？此實驗有何實際意義？實驗二、吞噬細(xì)胞吞噬羊紅細(xì)胞實驗實驗二、吞噬細(xì)胞吞噬羊紅細(xì)胞實驗【原理】吞噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞）具有對異物吞噬和消化的功能，在機(jī)體非特異免疫中具有重要意義。【材料】小鼠1%淀粉溶液（用生理鹽水配制）解剖器材，注射器，毛細(xì)滴管，橡皮吸頭，小試管及載玻片等瑞氏染液（已用pH6.2?6.4PBS稀釋3倍，甲醇以無菌注射器取已滅菌1%以無菌注射器取已滅菌1%淀粉溶液2?3ml注射于小鼠腹腔內(nèi)。次日（18?24h后），再注射0.5%羊紅細(xì)胞懸液2ml于小鼠腹腔內(nèi)。10?15min后將小鼠拉脫頸椎處死，用解剖剪剪開腹膜，再用毛細(xì)滴管吸取少量Hanks液沖洗腹腔并吸出腹腔液置于清潔小試管內(nèi)。視腹腔液內(nèi)細(xì)胞濃度多少，于載玻片上作成推片或涂片，自然干燥。加甲醇固定1m