免疫組織化學的雙重或多重標記1醫(yī)學ppt免疫組織化學的1醫(yī)學ppt2醫(yī)學ppt2醫(yī)學ppt3醫(yī)學ppt3醫(yī)學ppt要求：

1.掌握IHC多重標記染色的基本原理和技術要求2.了解常用方法類型及其優(yōu)缺點4醫(yī)學ppt要求：4醫(yī)學ppt概述應用IHC的方法在同一張組織切片上同時或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分，即謂雙重或多重免疫標記。顯示的水平可以是光鏡，也可以是電鏡5醫(yī)學ppt概述5常用方法類型有：按標記物分：免疫熒光雙重標記(FITC-TRITC)，免疫酶雙重標記(單酶雙底物-HRP:DAB與4CN/H2O2);AP:萘酚AS-MX/堅固紅與堅固藍；雙酶雙底物(HRP與AP，DAB/H2O2與萘酚AS-MX/堅固紅)；免疫膠體金標記(5nm與15nm)。6醫(yī)學ppt常用方法類型有：6醫(yī)學ppt

按標記抗體分：直接、間接法、復合物法等

按抗體制備動物來源分：異種動物抗體法與同種動物抗體法。

按有否洗脫去除第一重抗原抗體復合物分：洗脫法與非洗脫法。7醫(yī)學ppt按標記抗體分：直接、間接法、復合物法等7醫(yī)學一般多采用熒光或酶標間接法，混合試劑，不洗脫，光鏡以雙熒光或雙底物酶標記為多，顏色區(qū)別。電鏡以膠體金不同直徑顆粒(5nm與15nm)標記為多，顆粒大小區(qū)別。8醫(yī)學ppt一般多采用熒光或酶標間接法，混合試劑，不洗脫，一、基本原理雙重或多重標記是利用免疫學和細胞化學原理，在同一張切片上同時采用或先后采用不同顏色的熒光色素或酶促產(chǎn)物，或采用不同直徑大小顆粒膠體金來原位標記兩種或兩種以上抗原抗體復合物，9醫(yī)學ppt一、基本原理9醫(yī)學ppt達到在同一細胞或亞細胞水平顯示不同抗原成分(定性、定位、定量)，分析不同抗原成分相互間的功能關系，操作遵循的原則與要求同單標免疫組化方法。10醫(yī)學ppt達到在同一細胞或亞細胞水平顯示不同抗原成分(定性、定位、定量為了避免前重免疫標記與后重標記的交叉、重疊，其間可采用酸洗破壞(洗脫法)或飽和封閉(非洗脫法)加以克服。11醫(yī)學ppt為了避免前重免疫標記與后重標記的交叉、重疊，二、光鏡下的多重免疫標記染色（一）雙重免疫熒光標記染色采用呈現(xiàn)不同顏色的熒光色素配伍，分別標記不同的抗體，再通過各自與同一切片上的相應抗原特異性結合而加以區(qū)別顯示所建立起來的雙重或多重免疫組化染色技術。12醫(yī)學ppt二、光鏡下的多重免疫標記染色12醫(yī)學ppt常用的熒光素配伍主要為：異硫氰酸熒光素(FITC)呈綠色與羅丹明(RB200)或異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）呈紅色。技術方法敏感、特異，需選用各自特定的激發(fā)濾光片分別觀察或二次曝光顯影，樣本不能長期保存。13醫(yī)學ppt常用的熒光素配伍主要為：異硫氰酸熒光素(FI技術類型：有直接法和間接法之分。前者特異、快速，后者敏感、多用。所用抗體試劑可為異種動物抗體，也可為同種動物抗體。異種動物抗體?；旌蠎?，操作步驟少，脫片率相對較低。14醫(yī)學ppt技術類型：有直接法和間接法之分。前者特異、快同種動物抗體多分別應用，操作步驟加倍，脫片機率相對較高，前后重免疫熒光標記交叉重疊機會多，需用酸性洗脫或多聚甲醛蒸氣處理。15醫(yī)學ppt同種動物抗體多分別應用，操作步驟加倍，脫片機操作舉例：垂體腺瘤----ACTH與GH雙重免疫熒光標記染色（間接法）(1)石蠟切片，厚5μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4,0.01mol/L)。16醫(yī)學ppt操作舉例：垂體腺瘤----ACTH與GH雙重(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min（亦可用10％正常羊血清代之），不洗。(3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育30min37℃，濕盒。(4)0.05mol/LTBS(pH7.4,內含1％Triten×100,下同)洗，10min×3。17醫(yī)學ppt(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min17醫(yī)學ppt(5)羊抗鼠IgG-TRITC1:100，濕盒，室溫避光反應1h。(6)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3，(第一重ACTH-TRITC標記染色已完成)。18醫(yī)學ppt(5)羊抗鼠IgG-TRITC1:100，濕盒，室溫避光反(7)切片逐級酒精脫水，二甲苯透明，空氣干燥后，置于裝有多聚甲醛粉末的密閉容器內，放在80℃烤箱或溫箱內以甲醛蒸氣固定2～4h，使第一重染色中二抗的抗原結合部位失活。(8)切片以TBS洗，5min×419醫(yī)學ppt(7)切片逐級酒精脫水，二甲苯透明，空氣干燥后，置于裝有多聚(9)1％HSA（或10％正羊血清）孵育30min，室溫，濕盒，不洗。(10)抗GH血清(McAb)1:400，孵育30min，37℃，濕盒。(11)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×320醫(yī)學ppt(9)1％HSA（或10％正羊血清）孵育30min，室溫，(12)羊抗鼠IgG-FITC1:100,濕盒，室溫避光反應1h。(13)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3(第二重GH-FITC標記染色完成)。(14)緩沖甘油封片。21醫(yī)學ppt(12)羊抗鼠IgG-FITC1:100,濕盒，室溫避光反(15)熒光顯微鏡下分別以546nm及490nm波長的激發(fā)光觀察切片組織內TRITC及FITC所標示的ACTH及GH抗原（TRITC陽性細胞呈紅色，F(xiàn)ITC陽性細胞呈綠色）。22醫(yī)學ppt(15)熒光顯微鏡下分別以546nm及490nm波長的激發(fā)光(16)用彩色底片對切片同一部位用546nm及490nm波長激發(fā)光分別作兩次曝光，即可在同一張照片上顯示不同顏色標示的ACTH與GH兩種抗原。23醫(yī)學ppt(16)用彩色底片對切片同一部位用546nm及490nm波長TRITC-GAMIgG鼠抗人ACTH（IgG）FITC-GAMIgG鼠抗人GH（IgG）T游離FabTTTFGH抗原ACTH抗原FFab被滅活圖1同種動物抗體間接法（分步固定）雙重免疫熒光熒色原理24醫(yī)學pptTRITC-GAM鼠抗人ACTHFITC-GAM鼠抗人GHT二、多重免疫酶標記染色以酶催化不同底物呈現(xiàn)不同顏色產(chǎn)物標示同一切片內兩種或兩種以上抗原為理論基礎所建立起來的多重免疫標記染色方法。在光鏡下可以同時觀察和對比，樣品保存時間相對較長，一次曝光即可成像，故較雙重免疫熒光染色法更為常用。25醫(yī)學ppt二、多重免疫酶標記染色25醫(yī)學ppt

★常用標記酶與底物的配伍

單酶雙底物--HRP--DAB(棕色):4CN(藍色)AEC(紅色):4CN(藍色)AP-萘酚AS-MX-堅固紅(fastred紅色)-堅固藍(fastblue藍色)26醫(yī)學ppt★常用標記酶與底物的配伍26醫(yī)學ppt雙酶雙底物--HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-堅固藍)HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-堅固紅)（直接法、間接法、橋法均可使用，靈敏度以橋法中的復合物法最高，特異性則以直接法最佳）27醫(yī)學ppt雙酶雙底物--HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-堅固藍操作方法類同單酶標記，有直接法、間接法、復合物法之分。間接法與復合物法較常采用?！锊僮髋e例淋巴瘤輕鏈κ、λ的雙重酶標記（雙酶雙底物）28醫(yī)學ppt操作方法類同單酶標記，有直接法、間接法、復合(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟進水（若用含汞固定液固定的組織則需用0.5%碘的乙醇溶液脫汞5min，乙醇濃度為70％，經(jīng)自來水洗后，以2.5%硫代硫到鈉浸洗1min，水洗)；(2)0.3%H2O2甲醇液浸泡切片30min,自來水洗，蒸餾水洗,入PBS(0.01mol/LpH7.2);29醫(yī)學ppt(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟進水（若用含汞固定液固定的組織則需用0(3)滴加正羊血清1:10，濕盒，室溫，10min，不洗；(4)加一抗(抗人κPcAb與抗人λMcAb的混合液)1:200，濕盒，37℃，45min或更長；(5)PBS液，5min×330醫(yī)學ppt(3)滴加正羊血清1:10，濕盒，室溫，10min，不洗；3(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，溫盒，37℃，30min；(7)PBS洗，5min×3;(8)加酶抗酶抗體復合物(兔PAP＋鼠APAAP混合液1:100)，濕盒，37℃，30min；(9)PBS洗，5min×3；31醫(yī)學ppt(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，溫盒，3(10)過氧化物酶顯色反應：以DABH2O2液顯色7～10min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗，5min×3；(11)堿性磷酸酶顯色反應：以萘酚AS.MX及堅固藍(fastblue)顯色10～15min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗、自來水洗；(12)緩沖甘油封片，光鏡下觀察32醫(yī)學ppt(10)過氧化物酶顯色反應：以DABH2O2液顯色7～10注：若為同種動物抗血清，可分別進行標記染色，其間應經(jīng)多聚甲醛蒸氣處理4h或用pH2.2的甘氨酸---鹽酸溶液處理2h，以避免彼此的交叉反應。33醫(yī)學ppt注：若為同種動物抗血清，可分別進行標記染色，其間應經(jīng)多聚甲醛PPPAAAκλ圖2雙酶雙底物(復合物法)雙重酶標染色原理兔PAPGARIgG兔抗KAg鼠APAAPGAM.IgG鼠抗人34醫(yī)學pptPPPAAAκ★其它雙重標記法1.免疫熒光法與免疫酶法聯(lián)合應用(先酶標后熒光)2.免疫熒光法與免疫金銀法聯(lián)合應用(先免疫金銀標記后熒光標記)35醫(yī)學ppt★其它雙重標記法35醫(yī)學ppt3.免疫酶法與免疫金法聯(lián)合應用(20nm,紅色不宜用銀液放大，吸附干擾)4.免疫金銀法與免疫酶法聯(lián)合應用(對比明顯)36醫(yī)學ppt3.免疫酶法與免疫金法聯(lián)合應用(20nm,紅36醫(yī)學ppt三、電鏡下的雙重及多重免疫標記電鏡下的雙重免疫標記染色不是靠顏色區(qū)分，而是靠標記物的不同電子密度或顆粒的不同大小來區(qū)別不同抗原，有別于光鏡下的雙重免疫標記方法。37醫(yī)學ppt三、電鏡下的雙重及多重免疫標記37醫(yī)學ppt常用的方法多為雙重免疫金標記

優(yōu)點：高電子密度，分辨率高，抗原定位精確，顆粒大小可人工控制，標記試劑易制備。

缺點：試劑質量要求高，非特異吸附干擾大(背景)38醫(yī)學ppt常用的方法多為雙重免疫金標記38醫(yī)學ppt類型有直接法、間接法（異種動物抗體或同種動物抗體）----雙面染色，分步固定。標記用的膠體金顆粒，直徑多采用5nm,15nm組合，標記不同類別抗體(特異性一抗---直接法，間接抗體---間接法)。39醫(yī)學ppt類型有直接法、間接法（異種動物抗體或同種動物應用直接法進行多標，簡便、快速、準確、效果佳，尤多用于細胞表面抗原的雙重或多重標記。缺點：敏感性較低，金標抗體純度要求高。40醫(yī)學ppt應用直接法進行多標，簡便、快速、準確、效果佳金標抗體雙重抗原標記常用間接法顯示，且多采用異種動物抗體混合同步操作。優(yōu)點：敏感性提高，操作步驟減少缺點：標記二抗質量要求高，背景染色深?？赏ㄟ^采用固相吸附或過量二抗封閉，或用多聚甲醛蒸氣處理，使二抗的游離抗原結合部位（Fab段）滅活加以克服。41醫(yī)學ppt金標抗體雙重抗原標記常用間接法顯示，且多采用舉例：垂體組織生長激素(GH)和促腎上腺皮質激素(ACTH)雙重免疫電鏡染色(間接法)----分步固定。(1)取新鮮垂體腺瘤組織1mm3，蒸餾水洗，不經(jīng)餓酸固定，常規(guī)酒精脫水，用Lowicrylk4M包埋，超薄切片厚40nm，置無支持膜的鎳網(wǎng)上；42醫(yī)學ppt舉例：垂體組織生長激素(GH)和促腎上腺皮質激(2)以0.05mol/LTBS(pH7.4含1％TritonX-100，下同)，浸洗5min；(3)加入1％HSA5min；不洗；(4)以兔抗ACTH血清(1:200)孵育，4℃，20h，室溫下2h，TBS洗，用上述一抗重復孵育1次，TBS噴射沖洗，然后浸洗10min，3次，TBS(pH8.2)浸洗5min；43醫(yī)學ppt(2)以0.05mol/LTBS(pH7.4含1％(5)0.02mol/LTBS(pH8.2)浸洗5min；(6)1％HSA孵育5min，不洗；再以5nm膠體金標記的羊抗兔，IgG孵育10min；0.02mol/LTBS(pH8.2)噴射沖洗，0.05mol/LTBS(pH7.4)沖洗及浸洗，時間同前；44醫(yī)學ppt(5)0.02mol/LTBS(pH8.2)浸洗(7)蒸餾水浸洗后，空氣中干燥；(8)置盛有多聚甲醛粉末的密閉容器內，80℃溫箱中以多聚甲醛蒸氣處理1h，冷卻取出，入蒸餾水，換洗2次。45醫(yī)學ppt(7)蒸餾水浸洗后，空氣中干燥；45醫(yī)學ppt(9)再按(4)----(8)步驟作第二重抗原染色，這次一抗用鼠抗GH單克隆抗體(1:400)；二抗用15nm膠體金標記的羊抗鼠IgG，在二抗孵育并清洗后，入2％的戊二醛及3％多聚甲醛的TBS(pH7.4)溶液中固定30min，經(jīng)蒸餾水換洗3次，再以1％醋酸鈾和構櫞酸鉛作常規(guī)電子密度的染色。46醫(yī)學ppt(9)再按(4)----(8)步驟作第二重抗原染色，(10)電鏡觀察結果：見ACTH細胞和GH細胞的分泌顆粒分別被5nm和15nm的膠體金顆粒所顯示，除很少量背景染色外，標記位置精確，無交叉重疊與彌散現(xiàn)象。47醫(yī)學ppt(10)電鏡觀察47醫(yī)學ppt四、注意事項1.標記染色的順序確定需視組織標記抗原的性質，量少、脆弱先標記，量多、耐受后標記。48醫(yī)學ppt四、注意事項48醫(yī)學ppt2.結構保存與抗原保護并重，一般忌用餓酸后固定，PG固定液中的戊二醛(G)濃度不宜超過2％。3.嚴格操作步驟，洗滌需徹底，洗滌用的TBS中需加入1％Triton×100或Saponin。49醫(yī)學ppt2.結構保存與抗原保護并重，一般忌用餓酸后固定，PG固定液中4.保證試劑的清潔度與純度(雙蒸水，親和免疫層析)。5.封片劑選擇應注意顯色劑的溶解特性，一般多采用水封片(10%緩沖甘油)，保存時間不長，應及時觀察記錄結果。50醫(yī)學ppt4.保證試劑的清潔度與純度(雙蒸水，親和免疫層析)。50醫(yī)學此課件下載可自行編輯修改，供參考！感謝您的支持，我們努力做得更好！此課件下載可自行編輯修改，供參考！免疫組織化學的雙重或多重標記52醫(yī)學ppt免疫組織化學的1醫(yī)學ppt53醫(yī)學ppt2醫(yī)學ppt54醫(yī)學ppt3醫(yī)學ppt要求：

1.掌握IHC多重標記染色的基本原理和技術要求2.了解常用方法類型及其優(yōu)缺點55醫(yī)學ppt要求：4醫(yī)學ppt概述應用IHC的方法在同一張組織切片上同時或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分，即謂雙重或多重免疫標記。顯示的水平可以是光鏡，也可以是電鏡56醫(yī)學ppt概述5常用方法類型有：按標記物分：免疫熒光雙重標記(FITC-TRITC)，免疫酶雙重標記(單酶雙底物-HRP:DAB與4CN/H2O2);AP:萘酚AS-MX/堅固紅與堅固藍；雙酶雙底物(HRP與AP，DAB/H2O2與萘酚AS-MX/堅固紅)；免疫膠體金標記(5nm與15nm)。57醫(yī)學ppt常用方法類型有：6醫(yī)學ppt

按標記抗體分：直接、間接法、復合物法等

按抗體制備動物來源分：異種動物抗體法與同種動物抗體法。

按有否洗脫去除第一重抗原抗體復合物分：洗脫法與非洗脫法。58醫(yī)學ppt按標記抗體分：直接、間接法、復合物法等7醫(yī)學一般多采用熒光或酶標間接法，混合試劑，不洗脫，光鏡以雙熒光或雙底物酶標記為多，顏色區(qū)別。電鏡以膠體金不同直徑顆粒(5nm與15nm)標記為多，顆粒大小區(qū)別。59醫(yī)學ppt一般多采用熒光或酶標間接法，混合試劑，不洗脫，一、基本原理雙重或多重標記是利用免疫學和細胞化學原理，在同一張切片上同時采用或先后采用不同顏色的熒光色素或酶促產(chǎn)物，或采用不同直徑大小顆粒膠體金來原位標記兩種或兩種以上抗原抗體復合物，60醫(yī)學ppt一、基本原理9醫(yī)學ppt達到在同一細胞或亞細胞水平顯示不同抗原成分(定性、定位、定量)，分析不同抗原成分相互間的功能關系，操作遵循的原則與要求同單標免疫組化方法。61醫(yī)學ppt達到在同一細胞或亞細胞水平顯示不同抗原成分(定性、定位、定量為了避免前重免疫標記與后重標記的交叉、重疊，其間可采用酸洗破壞(洗脫法)或飽和封閉(非洗脫法)加以克服。62醫(yī)學ppt為了避免前重免疫標記與后重標記的交叉、重疊，二、光鏡下的多重免疫標記染色（一）雙重免疫熒光標記染色采用呈現(xiàn)不同顏色的熒光色素配伍，分別標記不同的抗體，再通過各自與同一切片上的相應抗原特異性結合而加以區(qū)別顯示所建立起來的雙重或多重免疫組化染色技術。63醫(yī)學ppt二、光鏡下的多重免疫標記染色12醫(yī)學ppt常用的熒光素配伍主要為：異硫氰酸熒光素(FITC)呈綠色與羅丹明(RB200)或異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）呈紅色。技術方法敏感、特異，需選用各自特定的激發(fā)濾光片分別觀察或二次曝光顯影，樣本不能長期保存。64醫(yī)學ppt常用的熒光素配伍主要為：異硫氰酸熒光素(FI技術類型：有直接法和間接法之分。前者特異、快速，后者敏感、多用。所用抗體試劑可為異種動物抗體，也可為同種動物抗體。異種動物抗體?；旌蠎?，操作步驟少，脫片率相對較低。65醫(yī)學ppt技術類型：有直接法和間接法之分。前者特異、快同種動物抗體多分別應用，操作步驟加倍，脫片機率相對較高，前后重免疫熒光標記交叉重疊機會多，需用酸性洗脫或多聚甲醛蒸氣處理。66醫(yī)學ppt同種動物抗體多分別應用，操作步驟加倍，脫片機操作舉例：垂體腺瘤----ACTH與GH雙重免疫熒光標記染色（間接法）(1)石蠟切片，厚5μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4,0.01mol/L)。67醫(yī)學ppt操作舉例：垂體腺瘤----ACTH與GH雙重(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min（亦可用10％正常羊血清代之），不洗。(3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育30min37℃，濕盒。(4)0.05mol/LTBS(pH7.4,內含1％Triten×100,下同)洗，10min×3。68醫(yī)學ppt(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min17醫(yī)學ppt(5)羊抗鼠IgG-TRITC1:100，濕盒，室溫避光反應1h。(6)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3，(第一重ACTH-TRITC標記染色已完成)。69醫(yī)學ppt(5)羊抗鼠IgG-TRITC1:100，濕盒，室溫避光反(7)切片逐級酒精脫水，二甲苯透明，空氣干燥后，置于裝有多聚甲醛粉末的密閉容器內，放在80℃烤箱或溫箱內以甲醛蒸氣固定2～4h，使第一重染色中二抗的抗原結合部位失活。(8)切片以TBS洗，5min×470醫(yī)學ppt(7)切片逐級酒精脫水，二甲苯透明，空氣干燥后，置于裝有多聚(9)1％HSA（或10％正羊血清）孵育30min，室溫，濕盒，不洗。(10)抗GH血清(McAb)1:400，孵育30min，37℃，濕盒。(11)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×371醫(yī)學ppt(9)1％HSA（或10％正羊血清）孵育30min，室溫，(12)羊抗鼠IgG-FITC1:100,濕盒，室溫避光反應1h。(13)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3(第二重GH-FITC標記染色完成)。(14)緩沖甘油封片。72醫(yī)學ppt(12)羊抗鼠IgG-FITC1:100,濕盒，室溫避光反(15)熒光顯微鏡下分別以546nm及490nm波長的激發(fā)光觀察切片組織內TRITC及FITC所標示的ACTH及GH抗原（TRITC陽性細胞呈紅色，F(xiàn)ITC陽性細胞呈綠色）。73醫(yī)學ppt(15)熒光顯微鏡下分別以546nm及490nm波長的激發(fā)光(16)用彩色底片對切片同一部位用546nm及490nm波長激發(fā)光分別作兩次曝光，即可在同一張照片上顯示不同顏色標示的ACTH與GH兩種抗原。74醫(yī)學ppt(16)用彩色底片對切片同一部位用546nm及490nm波長TRITC-GAMIgG鼠抗人ACTH（IgG）FITC-GAMIgG鼠抗人GH（IgG）T游離FabTTTFGH抗原ACTH抗原FFab被滅活圖1同種動物抗體間接法（分步固定）雙重免疫熒光熒色原理75醫(yī)學pptTRITC-GAM鼠抗人ACTHFITC-GAM鼠抗人GHT二、多重免疫酶標記染色以酶催化不同底物呈現(xiàn)不同顏色產(chǎn)物標示同一切片內兩種或兩種以上抗原為理論基礎所建立起來的多重免疫標記染色方法。在光鏡下可以同時觀察和對比，樣品保存時間相對較長，一次曝光即可成像，故較雙重免疫熒光染色法更為常用。76醫(yī)學ppt二、多重免疫酶標記染色25醫(yī)學ppt

★常用標記酶與底物的配伍

單酶雙底物--HRP--DAB(棕色):4CN(藍色)AEC(紅色):4CN(藍色)AP-萘酚AS-MX-堅固紅(fastred紅色)-堅固藍(fastblue藍色)77醫(yī)學ppt★常用標記酶與底物的配伍26醫(yī)學ppt雙酶雙底物--HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-堅固藍)HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-堅固紅)（直接法、間接法、橋法均可使用，靈敏度以橋法中的復合物法最高，特異性則以直接法最佳）78醫(yī)學ppt雙酶雙底物--HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-堅固藍操作方法類同單酶標記，有直接法、間接法、復合物法之分。間接法與復合物法較常采用?！锊僮髋e例淋巴瘤輕鏈κ、λ的雙重酶標記（雙酶雙底物）79醫(yī)學ppt操作方法類同單酶標記，有直接法、間接法、復合(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟進水（若用含汞固定液固定的組織則需用0.5%碘的乙醇溶液脫汞5min，乙醇濃度為70％，經(jīng)自來水洗后，以2.5%硫代硫到鈉浸洗1min，水洗)；(2)0.3%H2O2甲醇液浸泡切片30min,自來水洗，蒸餾水洗,入PBS(0.01mol/LpH7.2);80醫(yī)學ppt(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟進水（若用含汞固定液固定的組織則需用0(3)滴加正羊血清1:10，濕盒，室溫，10min，不洗；(4)加一抗(抗人κPcAb與抗人λMcAb的混合液)1:200，濕盒，37℃，45min或更長；(5)PBS液，5min×381醫(yī)學ppt(3)滴加正羊血清1:10，濕盒，室溫，10min，不洗；3(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，溫盒，37℃，30min；(7)PBS洗，5min×3;(8)加酶抗酶抗體復合物(兔PAP＋鼠APAAP混合液1:100)，濕盒，37℃，30min；(9)PBS洗，5min×3；82醫(yī)學ppt(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，溫盒，3(10)過氧化物酶顯色反應：以DABH2O2液顯色7～10min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗，5min×3；(11)堿性磷酸酶顯色反應：以萘酚AS.MX及堅固藍(fastblue)顯色10～15min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗、自來水洗；(12)緩沖甘油封片，光鏡下觀察83醫(yī)學ppt(10)過氧化物酶顯色反應：以DABH2O2液顯色7～10注：若為同種動物抗血清，可分別進行標記染色，其間應經(jīng)多聚甲醛蒸氣處理4h或用pH2.2的甘氨酸---鹽酸溶液處理2h，以避免彼此的交叉反應。84醫(yī)學ppt注：若為同種動物抗血清，可分別進行標記染色，其間應經(jīng)多聚甲醛PPPAAAκλ圖2雙酶雙底物(復合物法)雙重酶標染色原理兔PAPGARIgG兔抗KAg鼠APAAPGAM.IgG鼠抗人85醫(yī)學pptPPPAAAκ★其它雙重標記法1.免疫熒光法與免疫酶法聯(lián)合應用(先酶標后熒光)2.免疫熒光法與免疫金銀法聯(lián)合應用(先免疫金銀標記后熒光標記)86醫(yī)學ppt★其它雙重標記法35醫(yī)學ppt3.免疫酶法與免疫金法聯(lián)合應用(20nm,紅色不宜用銀液放大，吸附干擾)4.免疫金銀法與免疫酶法聯(lián)合應用(對比明顯)87醫(yī)學ppt3.免疫酶法與免疫金法聯(lián)合應用(20nm,紅36醫(yī)學ppt三、電鏡下的雙重及多重免疫標記電鏡下的雙重免疫標記染色不是靠顏色區(qū)分，而是靠標記物的不同電子密度或顆粒的不同大小來區(qū)別不同抗原，有別于光鏡下的雙重免疫標記方法。88醫(yī)學ppt三、電鏡下的雙重及多重免疫標記37醫(yī)學ppt常用的方法多為雙重免疫金標記

優(yōu)點：高電子密度，分辨率高，抗原定位精確，顆粒大小可人工控制，標記試劑易制備。

缺點：試劑質量要求高，非特異吸附干擾大(背景)89醫(yī)學ppt常用的方法多為雙重免疫金標記38醫(yī)學ppt類型有直接法、間接法（異種動物抗體或同種動物抗體）----雙面染色，分步固定。標記用的膠體金顆粒，直徑多采用5nm,15nm組合，標記不同類別抗體(特異性一抗---直接法，間接抗體---間接法)。90醫(yī)學ppt類型有直接法、間接法（異種動物抗體或同種動物應用直接法進行多標，簡便、快速、準確、效果佳，尤多用于細胞表面抗原的雙重或多重標記。缺點：敏感性較低，金標抗體純度要求高。91醫(yī)學ppt應用直接法進行多標，簡便、快速、準確、效果佳金標抗體雙重抗原標記常用間接法顯示，且多采用異種動物抗體混合同步操作。優(yōu)點：敏感性提高，操作步驟減少缺點：標記二抗質量要求高，背景染色深?？赏ㄟ^采用固相吸附或過量二抗封閉，或用多聚甲醛蒸氣處理，使二抗的游離抗原結合部位（Fab段）滅活加以克服。92醫(yī)學ppt金標抗體雙重抗原標記常用間接法顯示，且多采用