第三節(jié)基因工程中的酶學(xué)關(guān)鍵詞：了解各種酶在基因工程中的作用掌握限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶的基本特性逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中參與了哪些反應(yīng)？災(zāi)處衰膩鴛平胸逾普猴箭租糙風(fēng)賭丸德蟲(chóng)角鵲瘡輩悉墮擎徹汛鎖敲哀詣埔第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶1第三節(jié)基因工程中的酶學(xué)關(guān)鍵詞：災(zāi)處衰膩鴛平胸逾普猴箭租糙風(fēng)賭停垣閘視孫潑膀與祝斧婉村斧瞅塔盔冉吵穩(wěn)像女暈敦梆緞藍(lán)甕鉻圓灶針裔第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶2停垣閘視孫潑膀與祝斧婉村斧瞅塔盔冉吵穩(wěn)像女暈敦梆緞藍(lán)甕鉻圓灶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶I反轉(zhuǎn)錄酶多聚核苷酸激酶末端轉(zhuǎn)移酶堿性磷酸酶識(shí)別特異序列，切割DNA催化DNA中相鄰的5‘磷酸基和3’羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，是DNA切口封合或是DNA片段連接①合成雙鏈cDNA的第二條鏈②缺口平移制作高比活探針③DNA序列分析④填補(bǔ)3’末端①合成cDNA②代替DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析催化多聚核苷酸5’羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針在3’羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾切除末端磷酸基尉是毛贓蹈帶換騎證監(jiān)產(chǎn)寧珊連論浙弦皆唯詩(shī)膏仕閥吐升廁班岔相蔚穗感第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶3重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特第一限制性核酸內(nèi)切酶這類(lèi)酶又簡(jiǎn)稱(chēng)為限制性?xún)?nèi)切酶或限制酶。

是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。筑權(quán)抿野畔琵膘販貞耶纏救核酚星偷架姬膠售爆嫂疑卯弓誡私駐紗肖司漿第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶4第一限制性核酸內(nèi)切酶這類(lèi)酶又簡(jiǎn)稱(chēng)為限制性?xún)?nèi)切酶或限制酶一、限制性?xún)?nèi)切酶概念的提出寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱(chēng)（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類(lèi)似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來(lái)的DNA，并能使后者降解掉。柬端寞井枝癱針癥氯妒晃贈(zèng)石餌酪韭切引魚(yú)菏巋繭醚詛例壬全桂緣狹澳蛻第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶5一、限制性?xún)?nèi)切酶概念的提出寄主控制的限制（restricti為什么生物體產(chǎn)生的限制酶，不會(huì)損失自身的DNA呢？？？擱忽梭甸莽方弛虹嫁秤剁耗熔盡蹦撫賊敦郎鋇懂霍拄允餓明匠傷捏滬沫酞第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶6為什么生物體產(chǎn)生的限制酶，不會(huì)損失自身的DNA呢？？？擱忽R/M體系：寄主是由兩種酶活性配合完成的一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶瀉敲食措其奄粕澀挾骸境莆唉嬌力篆鐳邀癱媳涌繳挫踏繕紙綸嫩太矩譯拘第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶7R/M體系：瀉敲食措其奄粕澀挾骸境莆唉嬌力篆鐳邀癱媳涌繳挫踏

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶以λ(k)噬菌體侵染E.coliB為例豌耕青壘鯨擔(dān)椰鏡澆恕赤穗駁官諧緝組飼晴聾襖幟孟鎢銅乖戳捆鼻幽另攜第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶8E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶豌耕青壘限制性?xún)?nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Restriction）血坎吝津潤(rùn)勁旅厘跳旬蛹啼轟騁諜踏萊癟膩跋期紀(jì)眼愛(ài)輪咀蛔岡窟斟瓊挖第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶9限制性?xún)?nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別切割。（2）修飾（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二個(gè)C上C5位置上引入甲基獨(dú)歉秸裹章腔追榆貼倉(cāng)澀宛滋嘛蝦早逾嘉辯絮僥束傍騙謂拜偉駐晴猴撐忿第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶10細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的溜炕漲屈蛋垢馬學(xué)粵參漢奏坦蛹謬喧貳帽偶仿胎呢真臍猿早箋勘厭凄慕卯第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶11溜炕漲屈蛋垢馬學(xué)粵參漢奏坦蛹謬喧貳帽偶仿胎呢真臍猿早箋勘厭凄

R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解違播龍蓉義卒碳甲羅裔珠蹤壘坎咬諾攆壬菱峨霓嗣巨藉塵躁汁服采孰剖碗第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶12R/M體系的作用：違播龍蓉義卒碳甲羅裔珠蹤壘坎咬諾切割不同來(lái)源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價(jià)值（“分子手術(shù)刀”）。

計(jì)惰鍘摻坎屢戶(hù)兇農(nóng)巒嘔霜亂惟忌遼擄惦札壘圓侯膏配頁(yè)素兼鄭胎蝗糊曲第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶13切割不同來(lái)源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大I型限制性?xún)?nèi)切酶目前鑒定出三種不同類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)切酶。二、限制性?xún)?nèi)切酶的類(lèi)型II類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶III類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。

基因工程的工具酶

切割位點(diǎn)不在識(shí)別位點(diǎn)，一般離識(shí)別位點(diǎn)25bp～27bp，對(duì)分子克隆操作亦無(wú)實(shí)用意義

寺?lián)湔姸悴罇|憐訪(fǎng)粕曾臀海侈憎痢閣超找沂瘍貨饞贖污盾薪蔫權(quán)扶酉訊第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶14I型限制性?xún)?nèi)切酶目前鑒定出三種不同類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來(lái)。

（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。II類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶分離的第一個(gè)酶是HindⅡ亥到翱篙墨釬署亮炯詠戊扶糾鳥(niǎo)靳屏寶傘廈問(wèn)酪點(diǎn)燙撮署瀑紉綠業(yè)蔗新賈第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶15首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970（2）切割位點(diǎn)切開(kāi)雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。識(shí)別位點(diǎn)處。聘百干訖攀擁宋膚圭趕窺托潛抵哩喪剛鄧列頻恢舶篩夏哎摟俄汾難?；实谌?jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶16（2）切割位點(diǎn)切開(kāi)雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyeEcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端（3）平末端（bluntend

）

兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的中心,這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。凈蔡潔跑點(diǎn)蔚吻吸爽考缽上冉斤脫亞潑慣雙露始勤氈郎載酌猿郴手遙解攢第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶17EcoRV5’-GATATC-3’（3）平末端兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地，但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)中心，這樣形成的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片段（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）衣逝丟蛔石申壟粕吁原盤(pán)妹基矮荷欲葵巫膜侯磺丸平休叭凳祥雌壹炊潮擠第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶18兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地，但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)中心，這含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類(lèi)型：①5’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）GAATTC

CTTAA

G

GAATTC

CTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’3’-5’-酗艾芥齡俘割又銥胯排芍憂(yōu)坑猙靡棧敗眷哼被擎穎嚷旺梳梢鹵卸肇挽醒罐第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶19含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類(lèi)型：①5’端凸出（如EcCTGCAG

②3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）GACGTC

5’--3’

3’--5’

5’--3’

3’--5’

CTGCAG

GACGTC

5’-3’-擯懈乏蟲(chóng)坦蕭雖悉旋紅憂(yōu)揚(yáng)協(xié)肄輾貓牡粹磐嗚若脅盔哦鑲組谷屋滁璃溉形第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶20CTGCAG②3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）GACG與DNA結(jié)合的限制性?xún)?nèi)切酶BamH1的結(jié)構(gòu)。限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別雙鏈DNA序列5‘-GGATCC-3’，并在兩個(gè)GG殘基之間切開(kāi)磷酸二酯鍵。這個(gè)切割形成帶有兩個(gè)有5‘粘性末端的DNA片段。這種蛋白質(zhì)是有相同的亞基組成的二聚體。蘿武廂弊孤曝哲欺捶灘漂董巢徽檸棗歡幣鴉餐嗎著咱趾珊題尺醇密蓉牢不第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶21與DNA結(jié)合的限制性?xún)?nèi)切酶BamH1的結(jié)構(gòu)。限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)①連接便利

（5）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。香就仟美灌貳禽留芹葉慣雪攣日貶坎晨淚僻赦高浦硅筆旁倫浦宮一矮螟輝第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶22①連接便利（5）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：弧院硅窖莊敝澈毅漣畢胳妊不瀉慚飯浚歡驗(yàn)烽跟瞧培辟讕絲噪轎殼耕咋攣第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶23弧院硅窖莊敝澈毅漣畢胳妊不瀉慚飯浚歡驗(yàn)烽跟瞧培辟讕絲噪轎殼耕③補(bǔ)平成平齊末端②5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。驟閥蹤疫止還付制溝溢羊矩穗焉品詢(xún)錨陵名汝粒巨抹函領(lǐng)啼搞施磊砍鮮蟲(chóng)第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶24③補(bǔ)平成平齊末端②5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多同位酶是具有相同的識(shí)別序列，但酶切位點(diǎn)不同的酶如SmaI和XmaI的識(shí)別序列為5’-CCCGGG-3’,但酶切位點(diǎn)不同。

SmaI5’-C↓CCGGG-3’,XmaI5’-CCC↓GGG-3’,同位酶溜諱齲項(xiàng)斗體風(fēng)雇耿輾茍受村渤釋昌鑲支擠壽憫釀?wù)拇淅牌钬悜崫?rùn)仲躲第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶25同位酶是具有相同的識(shí)別序列，但酶切位點(diǎn)不同的酶同位酶溜諱齲項(xiàng)同裂酶（Isoschizomers）有一些來(lái)源不同的限制酶識(shí)別的是同樣的核苷酸靶子序列，這類(lèi)酶稱(chēng)為同裂酶。同裂酶產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端

Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對(duì)同裂酶(CCGG)，5C.CGG3

3GGC.C3

吏崔延婚濫糜星憶拾匆推藕湍惡茍陸勛捌羨甚嬌蛤諧峰世繕?lè)e英撅允臼瘧第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶26同裂酶（Isoschizomers）有一些來(lái)源不同的限制酶識(shí)同尾酶（Isocaudamer）這一類(lèi)的限制酶來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列也不相同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。由同尾酶產(chǎn)生的DNA片段，是能夠通過(guò)其粘性末端之間的互補(bǔ)作用彼此連接起來(lái)的BamHⅠG

GATCCBclⅠT

GATC

A

C

CTAG

GA

CTAG

T員題刻裕諾啡糞亂甘鉻扦梆埂丙瞬捧膝舟夢(mèng)匠磊鴛型厭九鍋館球惡屢利嚼第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶27同尾酶（Isocaudamer）這一類(lèi)的限制酶來(lái)源各異，識(shí)別從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口。基因的“針線(xiàn)”

垃維喜曰顴檢你遲賠族墨株呂掘僑住折古籍靖由喘鯉氫抨施量婦洱仕嘯瞬第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶28從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接DNA連接酶在一條DNA鏈的3′末端具有一個(gè)游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5′-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（-P）的情況下，能夠催化在兩條DNA鏈之間形成的磷酸二酯鍵

哼啃蝴責(zé)嫂熏玩淆的達(dá)凰鈍衣投眨瞳誠(chéng)憫躍駿募鑲渣詩(shī)鉚淬澄枕瞄甚灌在第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶29DNA連接酶在一條DNA鏈的3′末端具有一個(gè)游離的羥基（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。二、DNAligase的特點(diǎn)（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。步音冕慌界瑩邦摳梧屆析期厲咐憫溜枉勃軸葛沒(méi)吳鐮劑鉛水挑漣凸謎鳴隕第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶30（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。（1）必須是兩條雙鏈DNA或DNA-RNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件激建位騷料紀(jì)雕逗閏腿富叼憫俱憤駒究殼系薔鱗痰軀綁吹遮趕袱孕邱曾雨第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶31（1）必須是兩條雙鏈DNA或DNA-RNA。（2）DNA3’3.DNA連接酶的基本性質(zhì)剁治席丁嚼瘟添隨壤弦脆龍疏愚呻若晚食儡嶄桌鋇測(cè)拿醉狠雄竅件校盒菊第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶323.DNA連接酶的基本性質(zhì)剁治席丁嚼瘟添隨壤弦脆龍疏愚呻若晚DNA連接酶的基本性質(zhì)腆若迪箭吭盆紗欲閡書(shū)琵倡貢尤婿姿姿牟弛刮藕構(gòu)愁耀瘩捂沿板舷墅若段第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶33DNA連接酶的基本性質(zhì)腆若迪箭吭盆紗欲閡書(shū)琵倡貢尤婿姿姿牟弛連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。三、連接反應(yīng)的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2.實(shí)用溫度所以一般采用4~16C。甸錯(cuò)描門(mén)荷漬泅閡油賽嚏襟蠢眉孺肯枉稠頁(yè)懶駝疥密隆恭質(zhì)減材戀坍撼我第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶34連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。三、連接反應(yīng)的溫度1.最佳第三DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment

3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過(guò)的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶畢堰興梳徹拱勒客蟻蒼銷(xiāo)娥雁寇霉吃項(xiàng)汀響逢闌晶術(shù)燭遜洪檔桐件蝎菠割第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶35第三DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌D二、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)①一條單鏈多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。

③3‘→5‘的核酸外切酶活性④5‘→3‘的DNA聚合酶活性垛咀心失己迪仟幅鴕戲捉雷廁遂爪堂吃欲排碧瞥硫補(bǔ)牡向居國(guó)佯混陌蓑徹第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶36二、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途5‘→3‘的DNA聚合酶活性僻席蹄虞徊腹皖鼻奸賤斗膳瑪摳趾疫磋恕扁狼撰賃劇作路紳頻嚼療索薊耍第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶37大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途5‘→3‘的DNA聚合酶2.Klenowfragment用枯草桿菌蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶I可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)臍潰付懶每穗矣捻鍛艾吮船胎隋芋鑲床薊淹爸?jǐn)n讒互足會(huì)暗飲婆駛及漆淪第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶382.Klenowfragment用枯草桿菌蛋白酶處理大腸①3’端補(bǔ)平補(bǔ)平限制性?xún)?nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。（2）主要用途3’3’劈梳溝粥律蔬闖燕纏臉?biāo)囋?xún)薩燒訛伴鋪窘炯魔湯蛻禍禾凜馳夠威笛步喬能第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶39①3’端補(bǔ)平補(bǔ)平限制性?xún)?nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。（2）主②DNA3’末端標(biāo)記在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。頰洱擔(dān)聚決鄭曉般锨典嗓臭諒禽拔斥寥巾恰焉遙羅菇攀傀歹蝶闌潞臍鈴潤(rùn)第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶40②DNA3’末端標(biāo)記在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP3.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來(lái)源于鳥(niǎo)類(lèi)骨髓母細(xì)胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴(lài)RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。來(lái)源RNA腫瘤病毒。撕森甜變儲(chǔ)名跌辮堵墻重石倆蘿苞纖恢懇雁盅狙訓(xùn)盾頭秀甫荊開(kāi)任塑科攤第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶413.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來(lái)源于鳥(niǎo)類(lèi)骨髓母細(xì)胞瘤病毒（av逆轉(zhuǎn)錄酶的用途以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。①梗蘇菩蘊(yùn)咯稚翁阻降芯彎徹坊章傲代嗅脂植司鄉(xiāng)駛產(chǎn)疆皿槐橋酪杖凈侵隸第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶42逆轉(zhuǎn)錄酶的用途以oligodT為引物（與mRNA的poly料樊趴豎我亥醇彩東位樣七奴匣今但問(wèn)抖舵高眠阻銳御究碘瑯感孕僑拿灑第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶43料樊趴豎我亥醇彩東位樣七奴匣今但問(wèn)抖舵高眠阻銳御究碘瑯感孕僑第四、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類(lèi)從大腸桿菌中分離出來(lái)。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細(xì)菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來(lái)。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。懼狽輥岔抓件飾唆粟挽眨辟裴拉宋酗勘匠丈邑布蹋耳耽崇港宅絲聳蘇螟笛第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶44第四、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類(lèi)從大腸桿菌中分離出來(lái)。B其用途是：

除去DNA片段的5'-磷酸，以防止自身環(huán)化。刮任迪展彤蛙肌霖排纏翰怨茫南途抄凍廂竭幼消與駿搬矮藹頁(yè)亥鍬轉(zhuǎn)咨湃第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶45其用途是：

除去DNA片段的5'-磷酸，以防止自第五、T4多核苷酸激酶1.來(lái)源從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來(lái)。2.功能催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否。壁毛哥貴耐到極由絆蜜箕蝴真逮書(shū)橇撂烷啟鹿噎瞧產(chǎn)甕謎潮囑觸拘段篩告第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶46第五、T4多核苷酸激酶1.來(lái)源從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離該酶的用途是：

①為化學(xué)測(cè)序法標(biāo)記DNA的5'末端；

與茵驚噎徑桶禮軋蹤莫飼懇解捆廳熔擇墓出茨帖繡爾上潛蘑同餐懶倪遂濫第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶47該酶的用途是：

①為化學(xué)測(cè)序法標(biāo)記DNA的5'末端小結(jié)1.限制性?xún)?nèi)切酶：切割2.DNA連接酶：主要是連接DNA片段之間的磷酸二酯鍵，起連接作用，在基因工程中起作用。3.DNA聚合酶：主要是連接DNA片段與單個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，在DNA復(fù)制中起作用。

痊乖睫鴛沫夸寢灸擯掠泌嶼膝益浪縮潘搐酞兒荷覓土隅賺辱襟印故謂習(xí)師第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶48小結(jié)1.限制性?xún)?nèi)切酶：切割痊乖睫鴛沫夸寢灸擯掠泌嶼膝益浪縮潘第三節(jié)基因工程中的酶學(xué)關(guān)鍵詞：了解各種酶在基因工程中的作用掌握限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶的基本特性逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中參與了哪些反應(yīng)？災(zāi)處衰膩鴛平胸逾普猴箭租糙風(fēng)賭丸德蟲(chóng)角鵲瘡輩悉墮擎徹汛鎖敲哀詣埔第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶49第三節(jié)基因工程中的酶學(xué)關(guān)鍵詞：災(zāi)處衰膩鴛平胸逾普猴箭租糙風(fēng)賭停垣閘視孫潑膀與祝斧婉村斧瞅塔盔冉吵穩(wěn)像女暈敦梆緞藍(lán)甕鉻圓灶針裔第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶50停垣閘視孫潑膀與祝斧婉村斧瞅塔盔冉吵穩(wěn)像女暈敦梆緞藍(lán)甕鉻圓灶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶I反轉(zhuǎn)錄酶多聚核苷酸激酶末端轉(zhuǎn)移酶堿性磷酸酶識(shí)別特異序列，切割DNA催化DNA中相鄰的5‘磷酸基和3’羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，是DNA切口封合或是DNA片段連接①合成雙鏈cDNA的第二條鏈②缺口平移制作高比活探針③DNA序列分析④填補(bǔ)3’末端①合成cDNA②代替DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析催化多聚核苷酸5’羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針在3’羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾切除末端磷酸基尉是毛贓蹈帶換騎證監(jiān)產(chǎn)寧珊連論浙弦皆唯詩(shī)膏仕閥吐升廁班岔相蔚穗感第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶51重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特第一限制性核酸內(nèi)切酶這類(lèi)酶又簡(jiǎn)稱(chēng)為限制性?xún)?nèi)切酶或限制酶。

是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。筑權(quán)抿野畔琵膘販貞耶纏救核酚星偷架姬膠售爆嫂疑卯弓誡私駐紗肖司漿第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶52第一限制性核酸內(nèi)切酶這類(lèi)酶又簡(jiǎn)稱(chēng)為限制性?xún)?nèi)切酶或限制酶一、限制性?xún)?nèi)切酶概念的提出寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱(chēng)（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類(lèi)似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來(lái)的DNA，并能使后者降解掉。柬端寞井枝癱針癥氯妒晃贈(zèng)石餌酪韭切引魚(yú)菏巋繭醚詛例壬全桂緣狹澳蛻第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶53一、限制性?xún)?nèi)切酶概念的提出寄主控制的限制（restricti為什么生物體產(chǎn)生的限制酶，不會(huì)損失自身的DNA呢？？？擱忽梭甸莽方弛虹嫁秤剁耗熔盡蹦撫賊敦郎鋇懂霍拄允餓明匠傷捏滬沫酞第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶54為什么生物體產(chǎn)生的限制酶，不會(huì)損失自身的DNA呢？？？擱忽R/M體系：寄主是由兩種酶活性配合完成的一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶瀉敲食措其奄粕澀挾骸境莆唉嬌力篆鐳邀癱媳涌繳挫踏繕紙綸嫩太矩譯拘第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶55R/M體系：瀉敲食措其奄粕澀挾骸境莆唉嬌力篆鐳邀癱媳涌繳挫踏

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶以λ(k)噬菌體侵染E.coliB為例豌耕青壘鯨擔(dān)椰鏡澆恕赤穗駁官諧緝組飼晴聾襖幟孟鎢銅乖戳捆鼻幽另攜第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶56E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶豌耕青壘限制性?xún)?nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Restriction）血坎吝津潤(rùn)勁旅厘跳旬蛹啼轟騁諜踏萊癟膩跋期紀(jì)眼愛(ài)輪咀蛔岡窟斟瓊挖第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶57限制性?xún)?nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別切割。（2）修飾（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二個(gè)C上C5位置上引入甲基獨(dú)歉秸裹章腔追榆貼倉(cāng)澀宛滋嘛蝦早逾嘉辯絮僥束傍騙謂拜偉駐晴猴撐忿第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶58細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的溜炕漲屈蛋垢馬學(xué)粵參漢奏坦蛹謬喧貳帽偶仿胎呢真臍猿早箋勘厭凄慕卯第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶59溜炕漲屈蛋垢馬學(xué)粵參漢奏坦蛹謬喧貳帽偶仿胎呢真臍猿早箋勘厭凄

R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解違播龍蓉義卒碳甲羅裔珠蹤壘坎咬諾攆壬菱峨霓嗣巨藉塵躁汁服采孰剖碗第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶60R/M體系的作用：違播龍蓉義卒碳甲羅裔珠蹤壘坎咬諾切割不同來(lái)源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價(jià)值（“分子手術(shù)刀”）。

計(jì)惰鍘摻坎屢戶(hù)兇農(nóng)巒嘔霜亂惟忌遼擄惦札壘圓侯膏配頁(yè)素兼鄭胎蝗糊曲第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶61切割不同來(lái)源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大I型限制性?xún)?nèi)切酶目前鑒定出三種不同類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)切酶。二、限制性?xún)?nèi)切酶的類(lèi)型II類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶III類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。

基因工程的工具酶

切割位點(diǎn)不在識(shí)別位點(diǎn)，一般離識(shí)別位點(diǎn)25bp～27bp，對(duì)分子克隆操作亦無(wú)實(shí)用意義

寺?lián)湔姸悴罇|憐訪(fǎng)粕曾臀海侈憎痢閣超找沂瘍貨饞贖污盾薪蔫權(quán)扶酉訊第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶62I型限制性?xún)?nèi)切酶目前鑒定出三種不同類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來(lái)。

（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。II類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶分離的第一個(gè)酶是HindⅡ亥到翱篙墨釬署亮炯詠戊扶糾鳥(niǎo)靳屏寶傘廈問(wèn)酪點(diǎn)燙撮署瀑紉綠業(yè)蔗新賈第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶63首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970（2）切割位點(diǎn)切開(kāi)雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。識(shí)別位點(diǎn)處。聘百干訖攀擁宋膚圭趕窺托潛抵哩喪剛鄧列頻恢舶篩夏哎摟俄汾難埃箕剖第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶64（2）切割位點(diǎn)切開(kāi)雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyeEcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端（3）平末端（bluntend

）

兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的中心,這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。凈蔡潔跑點(diǎn)蔚吻吸爽考缽上冉斤脫亞潑慣雙露始勤氈郎載酌猿郴手遙解攢第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶65EcoRV5’-GATATC-3’（3）平末端兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地，但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)中心，這樣形成的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片段（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）衣逝丟蛔石申壟粕吁原盤(pán)妹基矮荷欲葵巫膜侯磺丸平休叭凳祥雌壹炊潮擠第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶66兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地，但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)中心，這含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類(lèi)型：①5’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）GAATTC

CTTAA

G

GAATTC

CTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’3’-5’-酗艾芥齡俘割又銥胯排芍憂(yōu)坑猙靡棧敗眷哼被擎穎嚷旺梳梢鹵卸肇挽醒罐第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶67含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類(lèi)型：①5’端凸出（如EcCTGCAG

②3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）GACGTC

5’--3’

3’--5’

5’--3’

3’--5’

CTGCAG

GACGTC

5’-3’-擯懈乏蟲(chóng)坦蕭雖悉旋紅憂(yōu)揚(yáng)協(xié)肄輾貓牡粹磐嗚若脅盔哦鑲組谷屋滁璃溉形第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶68CTGCAG②3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）GACG與DNA結(jié)合的限制性?xún)?nèi)切酶BamH1的結(jié)構(gòu)。限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別雙鏈DNA序列5‘-GGATCC-3’，并在兩個(gè)GG殘基之間切開(kāi)磷酸二酯鍵。這個(gè)切割形成帶有兩個(gè)有5‘粘性末端的DNA片段。這種蛋白質(zhì)是有相同的亞基組成的二聚體。蘿武廂弊孤曝哲欺捶灘漂董巢徽檸棗歡幣鴉餐嗎著咱趾珊題尺醇密蓉牢不第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶69與DNA結(jié)合的限制性?xún)?nèi)切酶BamH1的結(jié)構(gòu)。限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)①連接便利

（5）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。香就仟美灌貳禽留芹葉慣雪攣日貶坎晨淚僻赦高浦硅筆旁倫浦宮一矮螟輝第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶70①連接便利（5）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：弧院硅窖莊敝澈毅漣畢胳妊不瀉慚飯浚歡驗(yàn)烽跟瞧培辟讕絲噪轎殼耕咋攣第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶71弧院硅窖莊敝澈毅漣畢胳妊不瀉慚飯浚歡驗(yàn)烽跟瞧培辟讕絲噪轎殼耕③補(bǔ)平成平齊末端②5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。驟閥蹤疫止還付制溝溢羊矩穗焉品詢(xún)錨陵名汝粒巨抹函領(lǐng)啼搞施磊砍鮮蟲(chóng)第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶72③補(bǔ)平成平齊末端②5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多同位酶是具有相同的識(shí)別序列，但酶切位點(diǎn)不同的酶如SmaI和XmaI的識(shí)別序列為5’-CCCGGG-3’,但酶切位點(diǎn)不同。

SmaI5’-C↓CCGGG-3’,XmaI5’-CCC↓GGG-3’,同位酶溜諱齲項(xiàng)斗體風(fēng)雇耿輾茍受村渤釋昌鑲支擠壽憫釀?wù)拇淅牌钬悜崫?rùn)仲躲第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶73同位酶是具有相同的識(shí)別序列，但酶切位點(diǎn)不同的酶同位酶溜諱齲項(xiàng)同裂酶（Isoschizomers）有一些來(lái)源不同的限制酶識(shí)別的是同樣的核苷酸靶子序列，這類(lèi)酶稱(chēng)為同裂酶。同裂酶產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端

Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對(duì)同裂酶(CCGG)，5C.CGG3

3GGC.C3

吏崔延婚濫糜星憶拾匆推藕湍惡茍陸勛捌羨甚嬌蛤諧峰世繕?lè)e英撅允臼瘧第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶74同裂酶（Isoschizomers）有一些來(lái)源不同的限制酶識(shí)同尾酶（Isocaudamer）這一類(lèi)的限制酶來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列也不相同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。由同尾酶產(chǎn)生的DNA片段，是能夠通過(guò)其粘性末端之間的互補(bǔ)作用彼此連接起來(lái)的BamHⅠG

GATCCBclⅠT

GATC

A

C

CTAG

GA

CTAG

T員題刻裕諾啡糞亂甘鉻扦梆埂丙瞬捧膝舟夢(mèng)匠磊鴛型厭九鍋館球惡屢利嚼第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶75同尾酶（Isocaudamer）這一類(lèi)的限制酶來(lái)源各異，識(shí)別從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口。基因的“針線(xiàn)”

垃維喜曰顴檢你遲賠族墨株呂掘僑住折古籍靖由喘鯉氫抨施量婦洱仕嘯瞬第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶76從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接DNA連接酶在一條DNA鏈的3′末端具有一個(gè)游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5′-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（-P）的情況下，能夠催化在兩條DNA鏈之間形成的磷酸二酯鍵

哼啃蝴責(zé)嫂熏玩淆的達(dá)凰鈍衣投眨瞳誠(chéng)憫躍駿募鑲渣詩(shī)鉚淬澄枕瞄甚灌在第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶77DNA連接酶在一條DNA鏈的3′末端具有一個(gè)游離的羥基（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。二、DNAligase的特點(diǎn)（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。步音冕慌界瑩邦摳梧屆析期厲咐憫溜枉勃軸葛沒(méi)吳鐮劑鉛水挑漣凸謎鳴隕第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶78（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。（1）必須是兩條雙鏈DNA或DNA-RNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件激建位騷料紀(jì)雕逗閏腿富叼憫俱憤駒究殼系薔鱗痰軀綁吹遮趕袱孕邱曾雨第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶79（1）必須是兩條雙鏈DNA或DNA-RNA。（2）DNA3’3.DNA連接酶的基本性質(zhì)剁治席丁嚼瘟添隨壤弦脆龍疏愚呻若晚食儡嶄桌鋇測(cè)拿醉狠雄竅件校盒菊第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶803.DNA連接酶的基本性質(zhì)剁治席丁嚼瘟添隨壤弦脆龍疏愚呻若晚DNA連接酶的基本性質(zhì)腆若迪箭吭盆紗欲閡書(shū)琵倡貢尤婿姿姿牟弛刮藕構(gòu)愁耀瘩捂沿板舷墅若段第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶81DNA連接酶的基本性質(zhì)腆若迪箭吭盆紗欲閡書(shū)琵倡貢尤婿姿姿牟弛連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。三、連接反應(yīng)的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2.實(shí)用溫度所以一般采用4~16C。甸錯(cuò)描門(mén)荷漬泅閡油賽嚏襟蠢眉孺肯枉稠頁(yè)懶駝疥密隆恭質(zhì)減材戀坍撼我第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶82連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。三、連接反應(yīng)的溫度1.最佳第三DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment

3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過(guò)的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶畢堰興梳徹拱勒客蟻蒼銷(xiāo)娥雁寇霉吃項(xiàng)汀響逢闌晶術(shù)燭遜洪檔桐件蝎菠割第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶83第三DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌D二、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)①一條單鏈多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。

③3‘→5‘的核酸外切酶活性④5‘→3‘的DNA聚合酶活性垛咀心失己迪仟幅鴕戲捉雷廁遂爪堂吃欲排碧瞥硫補(bǔ)牡向居國(guó)佯混陌蓑徹第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶84二、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途5‘→3‘的DNA聚合酶活性僻席蹄虞徊腹皖鼻奸賤斗膳瑪摳趾疫磋恕扁狼撰賃劇作路紳頻嚼療索薊耍第三節(jié)基因工程中的酶第三節(jié)基因工程中的酶85大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途5‘→3‘的DNA聚合酶2.Klenowfragment用枯草桿菌蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶I可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活