熒光原位雜交（FISH）

Fluorescenceinsituhybridization熒光原位雜交（FISH）

Fluorescencein以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA，通過熒光標記顯示出來，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。

FISH原理以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNAFISH發(fā)展1969年，同位素標記的DNA探針；1974年，染色體顯帶技術(shù)與原位雜交結(jié)合；1981年，熒光素標記的cDNA探針；90年代后，多色探針出現(xiàn)。FISH發(fā)展1969年，同位素標記的DNA探針；探針的發(fā)展放射性標記：很難滿足靈敏度和分辨率這兩個原位雜交成功的條件，靈敏度要求放射性標記具有高中輻射能（P32），檔標記物能量過高時，會因為信號散射導致分辨率過低；如果使用低輻射能的放射性標記物（3H）可以得到較高分辨率，但由于靈敏度低而需要長時間曝光，并由此導致北京過高而難以分辨出真正信號。非放射性標記：常用的有生物素與熒光素。生物素一般通過連接到dUTP等核苷三磷酸上，這種經(jīng)修飾的核苷三磷酸再通過酶促反應(yīng)摻入到探針中；熒光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用下?lián)饺氲教结樦腥?，常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）、羧基熒光素（FAM）、四氯-6-羧基熒光素（TET）、吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等

探針的發(fā)展放射性標記：很難滿足靈敏度和分辨率這兩個原位雜交成探針制備

所謂核酸探針即是指一段用放射性核素或其他標記物（如酶與熒光素等）標記的與目的基因互補的DNA片段或單鏈DNA或RNA。根據(jù)其來源可分為“cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針與RNA探針”。

1.“cDNA探針”以mRNA為模板——在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成一條與mRNA互補的DNA鏈（cDNA）——用堿除去mRNA2.“基因組探針”是把染色體DNA通過超聲擊斷或以限制性內(nèi)切酶不完全水解——獲得許多染色體DNA隨機片段——擇長度約15-20kb（千對堿基）的DNA片段重組到λ噬菌體中——經(jīng)體外包裝轉(zhuǎn)染大腸桿菌——篩選出含目的基因的大腸桿菌——擴增后提取質(zhì)粒——酶切分離目的基因。

探針制備所謂核酸探針即是指一段用放射性核素或熒光原位雜交-課件3.“寡核苷酸探針”為人工合成的DNA片段，一般長約20-50個bp（堿基）?？筛鶕?jù)已知DNA或RNA序列合成精確互補的DNA探針；如不知核酸序列，可依據(jù)其蛋白產(chǎn)物的氨基酸順序推導出核酸序列合成DNA探針。由于DNA自動合成儀的出現(xiàn)使探針的合成十分方便。

4.“RNA探針”制備的技術(shù)路線為：將一段含完整或部分基因的DNA片段插入重組質(zhì)粒的多克隆位點——以內(nèi)切酶在插入片段中某一適當部位或在插入片段下游的某一部位消化重組質(zhì)?！怪蔀榫€性DNA——在相應(yīng)的DNA依賴性RNA聚合酶催化下，以含目的基因的DNA片段為模板合成RNA探針。由于RNA探針為單鏈，雜交時不存在第二條鏈的競爭，所以其敏感性較經(jīng)缺口平移標記的DNA探針要高。

3.“寡核苷酸探針”為人工合成的DNA片段，一般長約20-5探針的非放射性標記

間接標記：是采用生物素標記DNA探針，雜交后再用聯(lián)有熒光素的抗生物素抗體檢測。（可將檢測信號放大，監(jiān)測到小至５00bｐ的靶序列）

直接標記：是通過熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標記探針時摻入熒光素核苷三磷酸標記探針。（檢測步驟簡單，但不能將信號放大，不如間接標記的探針靈敏）探針的非放射性標記切口平移法：切口平移標記法先由胰DNA酶I在DNA雙鏈上隨機切口，大腸桿菌DNA聚合酶I作用以切口處開始，以另一條DNA鏈為模板，以4種三磷酸脫氧核苷酸為原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修復加入標記核苷酸同時進行，切口平行推移，可均一標記DNA鏈。（引物延伸法）本法與切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶來合成與模板互補的新的DNA鏈。由于DNA聚合必須從具有3’-OH的末端開始合成，因此與切口平移不同，引物延伸法需要一段與模序列互補的寡聚核苷酸作引物，將它與模板雜交，以提供3’-OH端。切口平移法：探針類型1、染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體、細菌人工染色體，主要用以識別染色體的易位、缺失和擴增。

2、染色體涂染探針，包括通過流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。3、染色體重復序列探針，主要是指著絲粒α-衛(wèi)星DNA重復序列探針和端粒重復序列探針，用以檢測染色體數(shù)目異常。

探針類型熒光原位雜交-課件染色體涂染探針：判斷易位染色體染色體涂染探針：判斷易位染色體熒光原位雜交-課件8號染色體探針α-衛(wèi)星DNA是唯一一個存在于所有人類染色體著絲粒區(qū)域的著絲粒DNA（centromereDNA，CEN-DNA）家族，由171bp的單體為單位組成的高度串聯(lián)重復片段，重復數(shù)百次至數(shù)千次，跨越長達100kb的著絲粒DNA區(qū)域，其雜交將產(chǎn)生很強的雜交信號。因此常被選為著絲粒探針的來源。

8號染色體探針α-衛(wèi)星DNFISH技術(shù)的優(yōu)點FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點：1、熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全；2、探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內(nèi)使用；3、實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。

。FISH技術(shù)的優(yōu)點FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下ApplicationsofFISH基因組結(jié)構(gòu)研究；染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析；病毒感染分析；人類產(chǎn)前診斷；腫瘤遺傳學；ApplicationsofFISH基因組結(jié)構(gòu)研究；基因組結(jié)構(gòu)研究基因組結(jié)構(gòu)研究染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析ViralInfectionsViralInfectionsPrenatalDiagnosis以21號染色體的相應(yīng)片段序列作探針，與外周血中的淋巴細胞或羊水細胞進行原位雜交，可快速、準確進行診斷。PrenatalDiagnosis以21號染色體的相應(yīng)片段xxxxxxxxxxx謝謝xxxxxxxxxxx謝謝熒光原位雜交（FISH）

Fluorescenceinsituhybridization熒光原位雜交（FISH）

Fluorescencein以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA，通過熒光標記顯示出來，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。

FISH原理以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNAFISH發(fā)展1969年，同位素標記的DNA探針；1974年，染色體顯帶技術(shù)與原位雜交結(jié)合；1981年，熒光素標記的cDNA探針；90年代后，多色探針出現(xiàn)。FISH發(fā)展1969年，同位素標記的DNA探針；探針的發(fā)展放射性標記：很難滿足靈敏度和分辨率這兩個原位雜交成功的條件，靈敏度要求放射性標記具有高中輻射能（P32），檔標記物能量過高時，會因為信號散射導致分辨率過低；如果使用低輻射能的放射性標記物（3H）可以得到較高分辨率，但由于靈敏度低而需要長時間曝光，并由此導致北京過高而難以分辨出真正信號。非放射性標記：常用的有生物素與熒光素。生物素一般通過連接到dUTP等核苷三磷酸上，這種經(jīng)修飾的核苷三磷酸再通過酶促反應(yīng)摻入到探針中；熒光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用下?lián)饺氲教结樦腥ィＳ玫臒晒馑赜挟惲蚯杷釤晒馑兀‵ITC）、羧基熒光素（FAM）、四氯-6-羧基熒光素（TET）、吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等

探針的發(fā)展放射性標記：很難滿足靈敏度和分辨率這兩個原位雜交成探針制備

所謂核酸探針即是指一段用放射性核素或其他標記物（如酶與熒光素等）標記的與目的基因互補的DNA片段或單鏈DNA或RNA。根據(jù)其來源可分為“cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針與RNA探針”。

1.“cDNA探針”以mRNA為模板——在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成一條與mRNA互補的DNA鏈（cDNA）——用堿除去mRNA2.“基因組探針”是把染色體DNA通過超聲擊斷或以限制性內(nèi)切酶不完全水解——獲得許多染色體DNA隨機片段——擇長度約15-20kb（千對堿基）的DNA片段重組到λ噬菌體中——經(jīng)體外包裝轉(zhuǎn)染大腸桿菌——篩選出含目的基因的大腸桿菌——擴增后提取質(zhì)?！盖蟹蛛x目的基因。

探針制備所謂核酸探針即是指一段用放射性核素或熒光原位雜交-課件3.“寡核苷酸探針”為人工合成的DNA片段，一般長約20-50個bp（堿基）。可根據(jù)已知DNA或RNA序列合成精確互補的DNA探針；如不知核酸序列，可依據(jù)其蛋白產(chǎn)物的氨基酸順序推導出核酸序列合成DNA探針。由于DNA自動合成儀的出現(xiàn)使探針的合成十分方便。

4.“RNA探針”制備的技術(shù)路線為：將一段含完整或部分基因的DNA片段插入重組質(zhì)粒的多克隆位點——以內(nèi)切酶在插入片段中某一適當部位或在插入片段下游的某一部位消化重組質(zhì)粒——使之成為線性DNA——在相應(yīng)的DNA依賴性RNA聚合酶催化下，以含目的基因的DNA片段為模板合成RNA探針。由于RNA探針為單鏈，雜交時不存在第二條鏈的競爭，所以其敏感性較經(jīng)缺口平移標記的DNA探針要高。

3.“寡核苷酸探針”為人工合成的DNA片段，一般長約20-5探針的非放射性標記

間接標記：是采用生物素標記DNA探針，雜交后再用聯(lián)有熒光素的抗生物素抗體檢測。（可將檢測信號放大，監(jiān)測到小至５00bｐ的靶序列）

直接標記：是通過熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標記探針時摻入熒光素核苷三磷酸標記探針。（檢測步驟簡單，但不能將信號放大，不如間接標記的探針靈敏）探針的非放射性標記切口平移法：切口平移標記法先由胰DNA酶I在DNA雙鏈上隨機切口，大腸桿菌DNA聚合酶I作用以切口處開始，以另一條DNA鏈為模板，以4種三磷酸脫氧核苷酸為原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修復加入標記核苷酸同時進行，切口平行推移，可均一標記DNA鏈。（引物延伸法）本法與切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶來合成與模板互補的新的DNA鏈。由于DNA聚合必須從具有3’-OH的末端開始合成，因此與切口平移不同，引物延伸法需要一段與模序列互補的寡聚核苷酸作引物，將它與模板雜交，以提供3’-OH端。切口平移法：探針類型1、染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體、細菌人工染色體，主要用以識別染色體的易位、缺失和擴增。

2、染色體涂染探針，包括通過流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。3、染色體重復序列探針，主要是指著絲粒α-衛(wèi)星DNA重復序列探針和端粒重復序列探針，用以檢測染色體數(shù)目異常。

探針類型熒光原位雜交-課件染色體涂染探針：判斷易位染色體染色體涂染探針：判斷易位染色體熒光原位雜交-課件8號染色體探針α-衛(wèi)星DNA是唯一一個存在于所有人類染色體著絲粒區(qū)域的著絲粒DNA（centromereDNA，CEN-DNA）家族，由171bp的單體為單位組成的高度串聯(lián)重復片段，重復數(shù)百次至數(shù)千次，跨越長達100kb的著絲粒DNA區(qū)域，其雜交將產(chǎn)生很強的雜交信號。因此常被選為著