揮發(fā)性植物源害蟲引誘劑篩選與混配方法的新視角摘要成蟲期是農(nóng)業(yè)害蟲世代發(fā)育鏈中容易實施人為干預的薄弱環(huán)節(jié)，利用植物源引誘劑誘殺成蟲具有微量高效、兼容配套、環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點。此前已經(jīng)篩選出了一些簡單配方，但其害蟲誘殺量占自然種群的比例以及誘殺選擇性還未達到令人滿意的水平。傳統(tǒng)化學生態(tài)學技術針對植物源害蟲引誘劑的篩選存在兩個難題，一是如何將組織程度較高的植物揮發(fā)物譜合理地分解為若干子系統(tǒng)，然后對其功能進行有機的耦合；二是針對數(shù)量眾多的電生理或行為活性成分，如何設計引誘劑配方并進行整體優(yōu)化。在這篇綜述中，作者指出了傳統(tǒng)化學生態(tài)學某些技術環(huán)節(jié)的不足之處；綜述了近年來國內(nèi)外植物源害蟲引誘劑篩選與應用的新思路以及人類調(diào)香術對于引誘劑研制的啟示；給出了電生理活性成分的正交組合測定法，以及引誘劑大田配方設計的關鍵方法——配方均勻設計的原理和案例。關鍵詞引誘劑，篩選，氣味環(huán)渡理論，超級混配法，配方均勻設計AbstractTheadultstageofagriculturalinsectpestsrepresentsawindowwithinwhichartificialinterferencecanaffecttheentiresubsequentgeneration.Plant-derivedattractantsthatareeffective,compatible,environmentallyfriendly,andlong-lastingresistancehaveprovendifficulttodevelop.Somesimpleattractantblendshavebeendeveloped,however,theireffectivenesswithrespecttobothluringasignificantproportionofthetargetspeciespopulation,andreducingtheproportionofbeneficialnon-targetinsectscaught,haveneverbeensatisfactory.Twobarriershinderthescreeningandblendingofplant-derivedattractantsusingtraditionalchemicalecologymethods;thefirstishowtorationallybreak-downahighlyorganizedplantvolatileprofileintoitsconstituentchemicalsandthentore-organizethesetoproducecompoundswithausefulbiologicalfunction,thesecondishowtodesignandoptimizeattractantblendsintrappingexperimentsaftertheidentificationofsomeindividualelectrophysiologicalorbehaviorallyactivecomponents.Inthisreview,wefirstdescribesometechnicalbottlenecksintraditionalchemicalecology;thenreviewsomerecentnovelideasforthescreeningandapplicationofplant-derivedattractants,includingtheimplicationsofperfumeryforattractantdevelopment.Finallywerecommendtwocomplementaryscreeningmethods;thefirstislaboratorybehavioralbioassayoftheorthogonalcombinationofelectrophysiologicallyactivecomponents,thesecondistheprinciplesofuniformformuladesign,whichisakeyblendingmethodforattractantsinfieldtrapping.Keywordsattractant,screening,scenttransitioncirculation,super-blending,formulauniformdesign在農(nóng)林害蟲世代發(fā)育鏈中，成蟲期是種群繁衍的關鍵階段，易受各種環(huán)境因子的影響，也是容易實施人為生態(tài)干預的薄弱環(huán)節(jié)（蘇建偉等，2001）。一方面，成蟲是擴散能力最強的蟲態(tài)，且取食、求偶和產(chǎn)卵主要依賴嗅覺（魯玉杰和張孝羲，2001）；另一方面，成蟲產(chǎn)卵寄主選擇決定著后代幼蟲分布（ThompsonandPellmyr，1991），補充營養(yǎng)狀況決定著產(chǎn)卵量和后代種群數(shù)量。許多農(nóng)業(yè)害蟲成蟲依賴植物花蜜作為補充營養(yǎng)，對花香揮發(fā)物的依賴大約從白堊紀晚期就已經(jīng)形成，故這類物質(zhì)極難使害蟲產(chǎn)生抗性（王玨，2013）。因此，可以用性信息素和植物源引誘劑等散布的點氣味源控制大尺度空間的成蟲運動，二者均具有微量高效、兼容配套、環(huán)境友好等優(yōu)點，易實現(xiàn)害蟲種群的可持續(xù)控制（李洋洋等，2014）。多數(shù)害蟲自然種群性信息素的配比具有進化穩(wěn)定性，模擬性腺中的自然比例就能制備出活性誘芯，許多害蟲種類的性信息素制劑已經(jīng)走向產(chǎn)業(yè)化之路（孟憲佐，2000；陳學新，2010），故作者主要討論配方設計相對困難的揮發(fā)性植物源引誘劑篩選與混配方法。對農(nóng)業(yè)害蟲具有引誘活性的植物種類以及植物源引誘劑配方篩選方面已經(jīng)出現(xiàn)了幾篇很好的綜述（RenouandGuerrero，2000；Cooketal.，2007），一些簡單配方也已經(jīng)篩選出來（MeagherandLandolt，2010），但害蟲誘殺量占自然種群的比例以及誘殺選擇性還未達到實際可用的水平（Bruceetal.，2002）。為了促進引誘劑的轉化，作者撰寫了本綜述。1揮發(fā)性植物源引誘劑篩選的途徑植物在受到昆蟲取食（Allmannetal.，2013）、產(chǎn)卵（MeinersandHilker，2000）和授粉（Muhlemannetal.，2006）之后，釋放的揮發(fā)物譜均有可能發(fā)生改變，這種揮發(fā)物譜也受鄰居植物的影響（Ninkovicetal.，2013）。揮發(fā)性植物源引誘劑篩選的傳統(tǒng)步驟如下：（1）獲得活性植物，比較不同生育期的引誘效果，并定位植物活性器官；（2）利用生物測定輔助的化學分離獲得粗提物或者活性餾分；（3）通過氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術（Gaschromatography-electroantennographicdetection，GC-EAD）等電生理技術縮小行為待測物質(zhì)的范圍；（4）采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（Gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）進行定性和定量分析；（5）電生理活性物質(zhì)的嗅覺行為活性；（6）配方優(yōu)化。在上述流程中，步驟（1）比較容易完成，步驟（4）相當成熟，其他步驟沒有普適性方案（閆鳳鳴，2011）。1.1化學分離植食性昆蟲究竟是如何依賴嗅覺識別寄主植物揮發(fā)物的？這個問題出現(xiàn)過兩個對立的觀點。第一個觀點認為植食性昆蟲對植物揮發(fā)性混合物的知覺建立在“整體印象”上（Sp?theetal.，2013）。例如，智利小植綏螨PhytoseiuluspersimilisAthias-Henriot對獵物二斑葉螨TetranychusurticaeKoch.為害的利馬豆PhaseoluslunatusLinnaeus誘導產(chǎn)生的30種揮發(fā)物中，除了正辛醇、順-3-己烯醇和水楊酸甲酯外，其他所有成分在單獨測試時均是無活性或驅(qū)避性的，而30種成分按照自然比例混合則對智利小植綏螨有很強引誘力（vanWijketal.，2008）；大豆釋放的15種揮發(fā)物中，10種在單獨測試時對黑豆蚜AphiscraccivoraKoch.有驅(qū)避作用，若將它們混合起來則能激發(fā)很強的正趨性反應，盡管混合物中各成分采用的濃度均是獨立測試時能激發(fā)最強驅(qū)避反應的濃度（Websteretal.，2010）。第二種觀點認為，植物的不同組織可以釋放數(shù)百種化合物，但是昆蟲的觸角只選擇對混合氣味中的少數(shù)成分做出反應，激發(fā)行為反應的甚至需要更少的氣味就行了（Rojas，1999；Zhangetal.，1999；Fraseretal.，2003），這方面的案例似乎比第一類更多（Sunetal.，2012）。事實上，這兩種觀點的對立可以追溯到還原論和整體論的對立。在一個無組織的系統(tǒng)中，每個子系統(tǒng)均可以顯示出整體的部分屬性；而在一個組織程度較高的系統(tǒng)中，各個組成部分之間的相互作用遠比這些構成要素本身更為重要。昆蟲究竟是依賴“整體印象”還是“關鍵組分”識別植物，差別在于植物揮發(fā)物譜組織程度的高低。在解析昆蟲的嗅覺知覺時，必須以適當?shù)姆绞綄]發(fā)物譜分解成某些適當?shù)淖酉到y(tǒng)，才能對各子系統(tǒng)的功能進行耦合，再現(xiàn)整體屬性。例如，在白菜籽象甲Ceuthorhynchusassimilis（Paykull）向油菜田遠距離遷移階段，3-丁烯基異硫氰酸酯、4-戊烯基異硫氰酸酯和2-苯乙基異硫氰酸酯起主要引誘作用，然而進入油菜田后異硫氰酸酯類物質(zhì)不再起作用，苯乙腈和苯甲醇誘導這種象甲優(yōu)先選擇開花的植株（SmartandBlight，1997），說明將油菜的氣味譜拆分為“十字花科葉片特征揮發(fā)物”和“花香氣味”兩個子系統(tǒng)是適合的。Li等（2005）在篩選黑楊PopulusnigraL.中引誘夜蛾的配方時發(fā)現(xiàn)，黑楊萎蔫葉片的揮發(fā)物按照氣相色譜中的保留時間順序，可以分為4大類“峰簇”：雜醇油類、綠葉氣味類、單萜和芳香族化合物類及長脂肪鏈化合物。將這些峰簇逐一按照自然比例混配進行誘捕測試，發(fā)現(xiàn)芳香族化合物峰簇在引誘夜蛾中最為關鍵。然而，現(xiàn)代分析儀器是將復雜氣味譜直接拆分成最小構成單位——分子，造成了后期配方篩選的盲目性，故萃取、蒸餾、吸附、過濾等GC-MS的前導步驟是非常重要的。然而，上述規(guī)律針對植物-昆蟲之間的相互通訊也不具有普適性。一般做法是通過柱層析將植物活性粗提物淋洗得到許多餾分，測試不同餾分組合的行為活性，盡可能地避免子系統(tǒng)被過度分解為更小的構成要素。在菜粉蝶PierisrapaeLinnaeus和暗脈菜粉蝶P.napioleraceaLinnaeus對蔥芥Alliariapetiolata（Bieb.）產(chǎn)卵接受度分化的研究中，作者們首先將蔥芥水提物分為丁醇可溶性部分和丁醇不溶性部分，進一步采用水-甲醇構成的溶劑系統(tǒng)淋洗有活性的丁醇不溶性部分，得到25個餾分。隨后作者分別測試下述餾分組合：Fr1–4、Fr5–10、Fr11–18和Fr19–25，成功地弄清了菜粉蝶和暗脈菜粉蝶對蔥芥產(chǎn)卵接受度分化的化學基礎（Huangetal.，1995）。遺憾的是，在引誘劑篩選中鮮見這樣的思路和做法?？傊谥参镌匆T劑篩選中，直接采用GC-MS分析原始提取物，往往會得到幾十種甚至數(shù)百種揮發(fā)物，其購置和合成困難，不利于澄清昆蟲與植物之間的化學通訊機制，故尋找構成化學指紋圖的“直接子系統(tǒng)”非常關鍵。1.2行為測定常用的室內(nèi)行為測試裝置有通管嗅覺儀、“Y”形嗅覺儀、“T”形嗅覺儀、四臂嗅覺儀等（閆鳳鳴，2011），現(xiàn)以最簡單常用的“Y”形嗅覺儀為例探討其存在的問題。首先，每頭試蟲僅有1次測試機會，一旦選擇了一個支臂，就很難調(diào)轉身體進入另一個，沒有利用前期經(jīng)歷糾正選擇的機會，故生態(tài)學關聯(lián)性較差。而野外的昆蟲往往通過行為上的試錯與不斷微調(diào)才能再認寄主。例如，無經(jīng)歷的智利小植綏螨并不偏好番茄受獵物二斑葉螨為害誘導的揮發(fā)物，然而暴露于受害番茄＋二斑葉螨混合放置的環(huán)境下超過15min的有經(jīng)歷個體，卻能夠?qū)ⅡφT導的植物揮發(fā)物與獵物的存在聯(lián)系起來（vanWijketal.，2008）。棉鈴蟲Helicoverpaarmigera（Hübner）自然種群偏好的蜜源寄主或產(chǎn)卵寄主往往是局部豐度較高的植物種類，這是由于野外與豐度較高的植物種類接觸頻次更高造成的（Jallowetal.，2004）。適合/不適合降落理論（Appropriate/inappropriatelandings）認為，所有情況下昆蟲首次選擇降落的植物，即使是“寄主”，也不足以通過跗節(jié)或頭部附肢的接觸性化學感器刺激昆蟲滯留在植物上。例如，在接受一種寄主產(chǎn)卵前，白菜根蠅DeliaradicumL.雌蟲在沿著植物產(chǎn)卵前平均要做4次盤旋飛行，在搜索合適產(chǎn)卵位置時，高刺激性植株只需訪問2片葉，而刺激性較低的植株上則需要訪問6片葉，菜粉蝶在產(chǎn)下第一粒卵之前總是與數(shù)種葉片接觸并做短距離飛行，只有當連續(xù)幾次降落在合適寄主植物上之后才會產(chǎn)卵（FinchandCollier，2000）。其次，研究者在統(tǒng)計時往往剔除測試結束時仍停留在主臂中的試蟲數(shù)量，但如果其所占比例特別大，有可能恰好代表了自然界最常見的個體，而選擇處理支臂或?qū)φ罩П鄣牟艖斠暈闃O端個體。而通過饑餓處理、延長觀察時間、縮短臂長、降低“選擇反應”標準（如進入支臂2/3即視為有效選擇）等方案則進一步喪失了生態(tài)學關聯(lián)性。此外，還有一種方法是在處理、對照支臂均輔助強引誘源如食物、光照、色板等，一些強引誘源有時會掩蓋處理和對照刺激之間本來應當統(tǒng)計顯著的差異。在樣品屬性未知且試樣較多時，標準引誘源的選擇是不可能的。最后，Y形嗅覺儀采集的數(shù)據(jù)類型為二項分布的頻次數(shù)據(jù)，一般采用Yate修正的2測驗進行分析。然而，這種統(tǒng)計方法將統(tǒng)計結果判定為“極顯著”、“顯著”和“不顯著”的范圍非常狹窄。例如，當測試總蟲數(shù)為50頭時，兩支臂選擇頻次之比為18︰32時會達到顯著性差異，15︰35時會達到極顯著差異，僅僅3頭試蟲改變其選擇就會造成統(tǒng)計結論的質(zhì)的變化；當測試蟲數(shù)為100頭時，40︰60會達到顯著性差異，37︰63會達到極顯著差異；當測試蟲數(shù)為1000頭時，469︰531會達到顯著性差異，460︰540會達到極顯著差異。這符合生物學直觀經(jīng)驗嗎？1.3傳統(tǒng)化學生態(tài)學中的電生理學技術觸角電位技術（Electroantennography，EAG）用來確認能夠激活昆蟲觸角電生理反應的成分，縮小行為測試物質(zhì)范圍，但不能明確化合物激發(fā)的行為類型。另外，觸角是和觸角葉、大腦聯(lián)合表征嗅知覺的，EAG值可以準確反映刺激物理量的大小，但感覺量與知覺量呈復雜的非線性關系。在心理學領域已有Weber-Fechner定律等數(shù)學模型來描述（彭聃齡，2004），但在昆蟲觸角電位測試時卻很少建立過有用的數(shù)學模型。行為反應和EAG反應有時會出現(xiàn)較大的偏差。例如，菜粉蝶對日本女貞Ligustrumjaponicum花香揮發(fā)物成分的喙伸展反應（Proboscisextensionresponse）與自然現(xiàn)象吻合，但和EAG測試結果偏差較大（Hondaetal.，1998）。Gregg等（2010）甚至認為觸角電位技術不能為棉鈴蟲引誘劑篩選帶來任何幫助。但客觀地講，有電生理活性的物質(zhì)不一定有行為活性，反過來，沒有觸角電生理活性的物質(zhì)具有行為活性的可能性更是微乎其微，因此該技術對于縮小行為待測物質(zhì)的范圍還是有一定輔助作用的。色譜是分離效能極高的分析技術，而昆蟲的觸角是高度靈敏的生物嗅覺檢測器，二者的優(yōu)勢互補就形成了GC-EAD技術，在性信息素研究領域得到了越來越廣泛的應用，但該系統(tǒng)并沒有克服以下局限性。首先，單獨的EAG測試中刺激間隔期一般是30s，以便保證離體觸角反應活性的恢復，而在GC-EAD操作中，刺激時間間隔卻是由植物揮發(fā)物中各成分在氣相色譜儀中的保留時間決定的，每種成分流經(jīng)觸角時的嗅覺疲勞程度無法實現(xiàn)標準化控制；其次，EAG測試中不同成分的刺激劑量可以精確控制，而在GC-EAD中每種化學成分的刺激量取決于其在揮發(fā)性混合物中的含量，電生理信號的大小可能與各成分的含量有關；再次，該技術難以克服兩種成分之間的協(xié)同現(xiàn)象。假設混合物中A和B兩種成分必須共存才能激發(fā)電生理或行為反應，但在GC-EAD裝置中它們由于保留時間的差異是先后刺激觸角的；最后，在進樣量的要求方面，GC與EAG之間存在尖銳的技術矛盾，為實現(xiàn)前者的色譜峰基線分離要求較小的進樣量和較大的分流比，但這樣一來，本來特異性就不很強的植物源信息化合物很容易淹沒于生物電生理噪聲中。因此，當前該技術大量應用于昆蟲性信息素領域，而在“特異性”不強的植物源引誘劑篩選應用相對較少，尤其是多食性害蟲種類的植物源引誘劑。未來隨著化學分析技術的進步，可能會徹底克服上述障礙，例如用自然植物氣味混合物刺激試蟲群體，然后捕獲有行為反應的個體，直接剪取觸角并分析其從總揮發(fā)物中吸附了哪些關鍵分子，得到觸發(fā)行為反應的活性物質(zhì)，即使嗅覺感受器的受體膜上有高效的降解酶系，根據(jù)其降解產(chǎn)物也容易推斷其前體，但目前的色譜檢測限尚難達到生物感受器的靈敏度。此外，昆蟲嗅覺信息的初級處理中心是觸角葉（Antennallobe），其中含有數(shù)目不等的基本構成單元即嗅小球（Glomerulus），在不同化學刺激作用下會發(fā)生特異性激活，這種激活圖式也能為昆蟲性信息素的植物源增效劑篩選提供許多有價值的信息，因為和觸角電位等技術相比，該技術檢測的是中樞嗅覺系統(tǒng)而不是外周嗅覺系統(tǒng)的變化，如海灰翅夜蛾Spodopteralittoralis（Boisduval）和煙草天蛾Manducasexta（Linnaeus）等模式昆蟲方面已經(jīng)進行的工作（Sadeketal.，2002；CarlssonandHansson，2003；Hanssonetal.，2003）。2揮發(fā)性植物源害蟲引誘劑篩選的新思路近年來在揮發(fā)性植物源引誘劑的篩選上出現(xiàn)了一些新思路，基本思想是將害蟲取食、產(chǎn)卵和求偶涉及的信息化合物進行整合；另外就是“超級混配法”（Super-blending）（Greggetal.，2010）和“氣味環(huán)渡理論”（林翔云，2008）。2.1不同行為意義的信息化合物整合盡管植物源引誘劑可以誘殺雌成蟲，但誘捕量相對較少，與性信息素混合使用是一個重要的思想（樊慧等，2004）。當前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了寄主植物揮發(fā)物對害蟲性信息素增效的大量事例（Nakamutaetal.，1997；MeagherandMitchell，1998；Rochatetal.，2000；Lightetal.，2001；Ochiengetal.，2002；Dengetal.，2004a,2004b；Yangetal.，2004；Schmidt-Büsseretal.，2009；vonArxetal.，2012），也出現(xiàn)了幾篇很好的綜述（LandoltandPhillips，1997；戴建青等，2010）。植物揮發(fā)物對昆蟲性信息素的增效機理大致可以歸納為4個方面：（1）寄主植物揮發(fā)物刺激雌蟲性信息素釋放量的增加；（2）寄主植物揮發(fā)物增強雄蟲對性信息素反應的靈敏度；（3）增強雄蟲對過高或過低劑量的性信息素的定向精度（王振華等，2008）。雙室串聯(lián)法可以用來鑒別機理（1）和（2），其中一個小室放置植物揮發(fā)物，另一個小室放置釋放性信息素的昆蟲，使?jié)崈艨諝庑蜇炐缘亓鬟^兩個小室，再作為氣味源輸送到嗅覺儀中，測試性信息素接受者的趨向反應，并與一個小室留空、另一個小室放置信息素源或者植物揮發(fā)物源的對照進行比對，根據(jù)植物揮發(fā)物是位于性信息素釋放者的上游顯著增效還是放在下游顯著增效判斷增效機理（Landoltetal.，1994）。我們認為，寄主?；暂^強的種類和/或飛行能力較差的種類最有可能發(fā)生這種協(xié)同作用。同種植物的花香揮發(fā)物和綠葉氣味之間也會發(fā)生嗅覺協(xié)同作用。例如，無經(jīng)歷的、饑餓的煙草天蛾未交配雌蛾對野生二倍體煙草Nicotianaattenuata和懷特曼陀羅Daturawrightii各自種內(nèi)花香揮發(fā)物與綠葉氣味混合物的趨性顯著比種間花香揮發(fā)物和綠葉氣味交叉結合（懷特曼陀羅花香氣味置于野生二倍體煙草植株葉片氣味背景下，或者煙草花香氣味置于懷特曼陀羅植株葉片氣味背景下）的趨性強，這種趨性屬于典型的取食引誘作用而不是產(chǎn)卵引誘作用（Kárpátietal.，2013）。需要指出的是，花香引誘劑一般是直接放在寄主植物田應用，作物田本身就具有綠葉氣味嗅覺背景，即使在室內(nèi)發(fā)現(xiàn)種內(nèi)花、葉揮發(fā)物的協(xié)同作用，在田間也可能因更加濃重的綠葉氣味背景而失去協(xié)同效應。又一種觀點認為上述種內(nèi)花葉揮發(fā)物結合并不必要，夜蛾類成蟲的蜜源寄主和產(chǎn)卵寄主往往是分離的，應用的基本方向是將蜜源寄主的花香氣味使用于產(chǎn)卵寄主田（李為爭，2003）。此外，信息化合物往往在不同情境下對昆蟲具有不同的行為學意義，即所謂的信息多義性（李洋洋等，2014）。例如，在寄主作物少數(shù)開花的情況下，棉鈴蟲會優(yōu)先選擇在開花植株上或附近產(chǎn)卵，某些開花期的非寄主植物上的落卵量比未開花的產(chǎn)卵寄主上還多（Cunninghametal.，1998，2006），暗示著花香揮發(fā)物與取食寄主和產(chǎn)卵寄主的選擇均有關系，已經(jīng)明確常見的花香揮發(fā)物苯乙醛與乙酸苯甲酯的二元混劑能夠增強棉鈴蟲性信息素的誘捕量（王玨，2013）。2.2超級混配法由于害蟲取食和產(chǎn)卵存在學習行為，害蟲自然種群對不同寄主作物的偏好程度與這些寄主作物的局部豐度有很大關系，故人工引誘劑如果在成分和配比上完全模擬某種引誘力強但豐度較低的寄主植物的話，可能會逐漸失效（Cunninghametal.，1999）。“超級混配法”即將對多食性害蟲成蟲有引誘力的數(shù)種植物共性成分混合，但混配比例不要模擬任何特定引誘性植物中的自然含量，這樣制備的配方不易受到蜜源背景氣味的干擾（delSocorroetal.，2010）。這樣的人工配方可能是創(chuàng)造了一種獨特的、組織程度較高的氣味譜系統(tǒng)，類似于調(diào)香術領域的“陳化（Aging）”現(xiàn)象（林翔云，2008）。害蟲引誘劑的應用中，誘捕夜蛾類害蟲常用的糖醋酒液引誘劑就利用了食醋、白酒等充分陳化的發(fā)酵物，其中白酒揮發(fā)物中痕量的3-甲基-1-戊醇和異戊醇等雜醇油成分對乙醇起著強化作用（Tóthetal.，2010），而食醋頂空揮發(fā)物中痕量的乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）則對乙酸起著強化作用（Becheretal.，2010）。又如，在單獨測試時，來自棉鈴蟲引誘性植物中的34種揮發(fā)物中僅7種有顯著引誘作用，6種顯著驅(qū)避；然當，多元配方混合測試時，31個配方中的21個有顯著引誘活性，僅1種顯著驅(qū)避，最有引誘力的配方包含4～6種成分。因此，配方的成分構成必須達到一定的復雜度（Greggetal.，2010）。但在寡食性煙草天蛾的研究中也發(fā)現(xiàn)了截然相反的現(xiàn)象。懷特曼陀羅和野生二倍體煙草葉片釋放的氣味對無經(jīng)歷的煙草天蛾雌蟲均具有很強的引誘力，但二者頂空揮發(fā)物混合在一起則沒有任何引誘作用（Sp?theetal.，2013）。這可能在于上述兩個研究所用的昆蟲種類食性方面存在較大差異。然而，我們認為“超級混配法”從理論上是可行的，但仍然僅是一個試錯性的概念。尋找某種多食性害蟲有引誘力的植物并鑒定其共性引誘活性成分相對容易，但怎樣“不模擬任何特定引誘性植物中的自然含量”而又要設計出最優(yōu)化的配方仍然需要大量的誘捕試驗。2.3氣味環(huán)渡理論人類調(diào)香產(chǎn)品方面已經(jīng)有了大量成熟的理論，可以為植物源害蟲引誘劑設計提供新思路?！皻馕董h(huán)渡理論”是將各種氣味排列在一個圓圖上（圖1），利用“相鄰補強、對角補缺”的規(guī)律指導香料之間的相互強化或相互掩蔽（林翔云，2008）。例如，令人厭惡的糞尿氣味分布在左下方，其相鄰位置是魚腥味和蝦蟹腥味，而在其相對方向則是樟腦香、桉葉香等，這就可以理解為什么要在衛(wèi)生間放置樟腦而不是死魚和死蝦等，當前急需要驗證該理論是否在不同害蟲的氣味感覺方面存在普適性，或總結出害蟲專用的氣味環(huán)渡理論。3基于應用數(shù)學的引誘劑篩選技術植物揮發(fā)物成分極為復雜，害蟲引誘劑不需要將所有成分全部混入，也不需要按其自然比例混配。研究難點主要有兩方面：一是植物揮發(fā)物譜怎樣合理地分解為若干子系統(tǒng)，準確再現(xiàn)害蟲對誘集植物揮發(fā)物的嗅覺識別機制；二是引誘劑配方的整體優(yōu)化，提高對靶標害蟲自然種群的誘殺量和降低對益蟲的殺傷作用。針對第一個難題，我們認為按照“次生代謝途徑”來分解氣味譜是合適的，即劃分為乙酰-丙二酸途徑產(chǎn)物（例如綠葉氣味）、乙酰-甲羥戊酸途徑（萜類）和莽草酸途徑（芳香族化合物）、糖酵解產(chǎn)物等，因為信息化合物的生態(tài)學意義就是為植食性昆蟲提供寄主存在以及營養(yǎng)質(zhì)量的信息，而唯獨次生代謝產(chǎn)物才能被植物彌散到大氣中并在較遠的距離被昆蟲識別，但次生代謝產(chǎn)物與基本營養(yǎng)物質(zhì)存在對應的生化關系；針對第二個難題，需要適于多因素、多水平的配方設計方案，中國數(shù)學家王元、方開泰開發(fā)的配方均勻設計可以有效地解決這個問題。結合上述傳統(tǒng)化學生態(tài)學步驟的薄弱環(huán)節(jié)，我們從柱層析、電生理活性化合物行為篩選、誘捕配方設計三方面提出一些建議。3.1采用逐步減少餾分組合法對柱層析產(chǎn)物進行行為測定柱層析是植物材料初步篩選和后期化學分析之間的關鍵步驟。一般選擇沸點較低、相互可溶的兩種溶劑（如石油醚-乙醚，二氯甲烷-乙醚，正己烷-乙酸乙酯），按不同體積比混成一系列淋洗液，將活性粗提物樣品置于層析柱中，按極性最弱到極性最強的順序依次淋洗并分別收集相應餾分，每個餾分收集1～5mL，餾分收集總數(shù)圖1人類嗅覺感覺的自然界氣味環(huán)渡理論圖（林翔云，2008）Fig.1Transitioncirculationdiagramofnaturalscentsbasedonthesmellofhumanbeings(Lin,2008)以10～20個為宜。采用從末端逐步減少餾分的方法進行生物測定，以等當量母液為參照，獲得生物活性和母液差異不顯著的最簡餾分組合，再進行GC-MS或GC-EAD測定。假設收集了10個餾分，按照收集順序分別編號為Fr1、Fr2、Fr3……Fr10。第一步，將所有餾分全部混合起來，濃縮后與母液進行生物活性比較，判斷淋洗溶劑系統(tǒng)是否有效；第二步，從餾分全組合中去除Fr10，濃縮后再次與母液比較，若活性相當則進一步去掉Fr9和Fr10。該過程持續(xù)進行，直到去掉某個餾分后生物活性和母液相比顯著下降為止。然后保留該餾分并從另一端開始重復上述篩選步驟，從而獲得最簡活性餾分。3.2采用兩水平正交設計對電生理活性物質(zhì)進行篩選經(jīng)過初步篩選后電生理活性物質(zhì)一般不超過15個，適合采用2水平正交設計進行行為測定。假設獲得了6種電生理活性物質(zhì)（A、B、C、D、E和F），兩個水平分別是某物質(zhì)在配方中不存在和以自然濃度存在（表中的“＋”），試驗指標是引誘百分率（a、b、c、d、e、f、g和h）。應當選擇L8(27)正交表，將6種成分隨機安排在表16種電生理活性物質(zhì)的L8(27)正交設計方案示例Table1ExampleofanL8(27)orthogonaldesignforbehavioralbioassayofsixcandidateelectrophysiologicalactivecompounds配方中的電生理活性成分ElectrophysiologicalactivecomponentsinblendsAB空白CK?1101?配方編號Blendcode引誘百分率PercentageofattractionCDEF＋＋＋＋＋＋bce11a21＋3＋4＋5678K1K2＋＋＋＋2＋2＋＋＋dfg＋h2＋2＋＋＋1＋1＋a＋b＋c＋da＋b＋e＋fa＋b＋g＋ha＋c＋e＋ga＋c＋f＋ha＋d＋e＋ha＋d＋f＋ge＋f＋g＋ha＋d＋g＋hc＋d＋e＋fb＋d＋f＋hb＋d＋e＋gb＋c＋f＋gb＋c＋e＋hK2B–K1BK2–K1K2C–K1CK2D–K1DK2E–K1EK2F–K1FRK2A–K1A表中第2行的大寫字母代表7種成分的編號，最后一列的小寫字母表示8個相應配方的引誘百分率，K1和K2是正交設計極差分析步驟引入的中介變量，其下角標代表的是水平編號，R指的是極差，即某一因素列下方一系列K值的最大值和最小值之差。Capitallettersinthesecondrowrepresentcodesofthesevencomponents,smalllettersinthelastcolumnindicateattractingpercentagesoftheeightcorrespondingblends,“K1”and“K2”indicatemediatorvariablesintherangeanalysisoforthogonaldesign,whosesubscriptsrepresentlevelcode,“R”indicatesrange,i.e.thedifferenceofmaximumKvaluesubtracttheminimumKvalueinacertainfactorcolumn.7個列上并留下1個空白列估計隨機誤差（表1中為第3列）。測試結束后，通過極差分析和方差分析判斷各成分的效應是否顯著，哪些成分是冗余的，哪些是關鍵組分。正交設計的極差分析可以借助Microsoftexcel軟件直接進行，方差分析可方便地通過SPSS統(tǒng)計軟件的一般線性模型完成。3.3以配方均勻設計為指導的野外誘捕任何電生理、行為學等研究結果最終必須放在自然環(huán)境下檢驗才有可能被推廣應用，而大田誘捕是實現(xiàn)該目的的終端步驟，也是植物源引誘劑研發(fā)最困難的環(huán)節(jié)。當前國內(nèi)外植物源引誘劑的許多配方是憑隨機合成篩選得到的，耗時長，代價大。例如，在薔薇刺鰓金龜MacrodactylussubspinosusFabricius引誘劑的配方優(yōu)化中，第1個季節(jié)比較了20種化合物與標準引誘劑（纈草酸＋己酸＋丁酸辛酯=1︰1︰1）的活性，發(fā)現(xiàn)并確定了2個引誘劑配方（纈草酸＋1-壬醇=1︰1；纈草酸＋己酸＋丁酸辛酯＋1-壬醇=1︰1︰1︰1）優(yōu)于標準引誘劑，研究者將二者確定為“新標準引誘劑”；第2個季節(jié)將36種化合物單劑與新標準引誘劑對比，發(fā)現(xiàn)上述“新標準引誘劑”中的1-壬醇如果替換成其同系物(E)-2-壬烯醇后則誘捕效能大大提高；第3次試驗采用29種新的候選化合物與纈草酸復配，并與“新標準引誘劑”之一（纈草酸＋己酸＋丁酸辛酯＋1-壬醇=1︰1︰1︰1）進行比較，發(fā)現(xiàn)α-紫羅蘭酮＋纈草酸引誘力更強；最后研發(fā)了一種新的五元組分誘芯：纈草酸＋己酸＋丁酸辛酯＋(E)-2-壬烯醇＋α-紫羅蘭酮（Williamsetal.，2000）。即使如此，這個五元配方也不一定是最優(yōu)的，因為其中各種化合物均為等比例混合，微調(diào)一下相對含量也許效果更好。類似案例還有日本弧麗金龜PopilliajaponicaNewman、玉米根螢葉甲DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte、油菜露尾甲MeligethesaeneusFabricius及各種金翅夜蛾花香成分引誘劑研究，因篇幅所限參考文獻不再列出。另一種常見的方式是模擬設計（Simulationdesign），即模擬自然植物釋放揮發(fā)物的成分及其比例，購買純試劑進行混合和大田檢驗，該方法適于活性物質(zhì)種類單一、特異性強的配方，如性信息素。但植物源引誘劑往往活性物質(zhì)種類較多，特異性并不強，不同成分之間的相互作用關系非常復雜，這種配方因大田背景氣味的強干擾作用，很難做到“源于自然，超越自然”。例如，Gregg等（2010）發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲引誘劑的配方不必模擬任何一種蜜源寄主或者產(chǎn)卵寄主揮發(fā)物的配比，人工制備的配方效果更強，其他的多食性害蟲可能普遍存在這個現(xiàn)象。后來出現(xiàn)了單純形格子點設計和單純形重心設計等（李云雁和胡傳榮，2008）。在單純形格子點設計中，設正規(guī)單純形的高為1，這樣在正規(guī)單純形組成的超幾何空間中，各個點到各邊（或面）的距離總和為1，因此這些點可以方便地用來表示各成分組成的配方在超幾何空間中的分布。例如，假設有3種組分A、B和C，其2階單純形格子點設計的6個配方如下：（1）100%A；（2）100%B；（3）100%C；（4）50%A＋50%B；（5）50%A＋50%C；（6）50%B＋50%C。可以看到，這6個配方中沒有1個包含所有3種組分。3種成分的3階單純形的10個配方中才僅僅包含一個3種成分的等比例混合物。如果在害蟲引誘中必須3種成分協(xié)同才能發(fā)生作用，那么事實上仍無研究3成分之間劑量相互作用的機會（圖2：左）。這種設計的缺陷是試驗點分布在單純形頂點和邊線上的過多，而單純形空間內(nèi)部的試驗點太少，需要的試驗次數(shù)隨著組分數(shù)和階數(shù)（即每種成分的水平數(shù)）上升快速增多。假設組分數(shù)為m，每種成分的水平數(shù)為d，則試驗的總配方數(shù)計算公式為：{m,d}(md1)!d!(m1)!適于植物源害蟲引誘劑配方設計方法主要有正交設計（Orthogonaldesign）和配方均勻設計（Formulauniformdesign）兩種，前者適于待測物質(zhì)較多時的情況，這時每種物質(zhì)的劑量水平數(shù)不能太多，常用于初步篩選，而后者適用于活性物質(zhì)已經(jīng)明確且數(shù)量不很多、但需要精益求精地優(yōu)化配方時。兩種設計有機結合是大田引誘劑篩選最關鍵的途徑。配方均勻設計的基本思想是通過MonteCarlo模擬或數(shù)論的方法在因素×水平組成的超幾何多面體內(nèi)部找到一系列有代表性的試驗點，每個點代表一個多元配方，使這些點在該空間盡可能散布均勻。實際應用中，常利用配方均勻設計表[UFn(nm)或UF*n(nm)]來設計配方，n代表一組優(yōu)化試驗制備的總配方數(shù)或每個成分的劑量數(shù)，m代表配方中的組分數(shù)，根據(jù)配方均勻設計表相應的使用表進行配方設計。試驗完成后利用逐步回歸法剔除無關因素，或引入二階交互項、二次項等虛擬變量，獲得高效、簡易的配方（李云雁和胡傳榮，2008）。例如，此前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)花香揮發(fā)物中具有誘蛾活性的多是芳香族化合物，但采用配方均勻設計進行野外誘捕卻發(fā)現(xiàn)，一個最優(yōu)的配方僅苯乙醛、乙酸苯甲酯和水楊醛3種成分就夠了，而經(jīng)常報道的兩種活性成分苯甲醛和苯甲醇的混入反而對多數(shù)蛾類的誘捕具有普遍的抑制作用（李為爭等，2014）。以3種組分為例，在總配方數(shù)均為10個的情況下，配方均勻設計與單純形格子點試驗點的分布對比如圖2（左）所示，總配方數(shù)為15個的情況下兩種設計方法的對比如圖2（右）所示。從中明顯可以看出，配方均勻設計中試驗點在3種組分的配方構成空間中散布的更加均勻。現(xiàn)以5種成分、每種成分15個劑量水平為例，逐步介紹該方法的實施。第一步，構造均勻設計表[U15(158)]。首先在第一列輸入1～15，在第一行上輸入比15小、且與15互質(zhì)的數(shù)字，分別是1、2、4、7、8、11、13、14；然后在每個交叉格中計算出該交叉格對應的行與列數(shù)字的乘積關于15的同余（表2）。例如，第6列第3行的交叉格中，列的數(shù)字是11，行的數(shù)字是3，交叉中的的數(shù)字即為：mod(11×3，15)=mod(33，15)=mod(2×15+3，15)=3。圖2相同試驗次數(shù)情況下配方均勻設計與單純形格子點設計的試驗點分布對比Fig.2Comparisonofformulauniformdesignandsimplex-latticedesignwiththesametotalexperimentnumbers黑點表示配方均勻設計的試驗點，白點表示單純形格子點設計的試驗點。左：成分數(shù)為3，總配方數(shù)為10，配方均勻設計采用的是UM*10(103)表，單純形格子點集為{3,3}；右：成分數(shù)為3，總配方數(shù)為15，配方均勻設計采用的是UM15(153)表，單純形格子點集為{3,4}。SolidpointsinthefiguresindicatetheblendsofFormulaUniformDesign,andhollowpointsindicatethoseofsimplex-latticedesign.Left:Threecomponents,atotaloftenblends,comparisonofUM*10(103)and{3,3}Simplex-latticeDesign;Right:Threecomponents,atotaloffifteenblends,comparisonofUM15(153)and{3,4}Simplex-latticeDesign.表25種成分、每種成分15個劑量水平的均勻設計表[UM15(155)]及其生成過程Table2GenerationprocessofthefinalFormulaUniformDesigntablewith5componentsand15doselevelseach[UM15(155)]均勻設計表因素列試驗號FactorcolumnExperimentNo.123456789101112131415C值表C-valuetableC1C2C3C4C5UM15(155)各組分百分含量PercentcontentinUM15(155)x1x2x3x4x5124836975310.030.830.550.000.900.700.470.770.370.570.360.180.030.500.030.830.430.310.140.450.020.080.300.630.300.300.300.260.100.270.770.570.710.430.900.830.230.030.190.030.070.550.170.500.030.100.700.900.160.570.190.030.060.570.170.370.170.770.130.350.630.300.630.630.630.110.200.700.430.900.100.500.090.220.040.590.070.770.570.170.570.370.060.160.430.700.430.030.230.040.110.290.540.020.900.830.700.500.100.030.060.150.380.380.970.970.970.970.970.010.010.020.030.934815612971413910510101171413141381286421215“均勻設計表因素列”中第5、6、8三列下方的水平代碼刪除線表示，根據(jù)均勻設計表的使用表，這些列在本案例的轉化過程中不使用。Thestrikethroughsonthelevelcodesinthefifth,sixth,andtheeighthcolumnsinthefactorcolumnsindicatethatthesecolumnsshouldbediscardedduringthetransformationprocessinthiscase,basedontheutilizationtableofUniformDesign.第二步，根據(jù)U15(158)均勻設計表的使用表，如果是5種組分（即5個因素），應當使用第1、2、3、4、7列，將用不到的列全部刪除，得到U15(155)表。第三步，將上述U15(155)表轉換成C值表，C值表每個交叉格中的數(shù)字計算公式如下：cqji1ji22n,j1,2,.......m1其中j表示第j列（注意這里的“j”指的是按從表格中左到右的實際列順序編號，不是上表中第一行的數(shù)字），i表示第i行。Cji是表2中C值表交叉格中的數(shù)字，qji是均勻設計表中相應的表格數(shù)字，n為試驗總次數(shù)15。第四步，將C值表轉換成配方均勻設計表UM15(155)。該表中除了最后一列外，每個交叉格中的數(shù)字計算公式如下：1j1xji(1Cmjij1)Ckimkk1以第1行為例，第j列交叉格中的數(shù)字計算公式是：xj[1(m(m(m...(mj最后一列中每一行的數(shù)字等于該行前幾列數(shù)字之和被1減除。這樣即得配方均勻設計表。很顯然，這樣的設計不存在兩種組分劑量反應之間的共線性現(xiàn)象，所有的試驗點在5維超幾何多面體中是均勻散布的。試驗完成之后，以試驗指標（針對本文指的是誘捕量等）為因變量，5種成分為自變量，建立多元一次回歸方程，并檢驗回歸系數(shù)和相關系數(shù)的顯著性，采用逐步回歸法剔除冗余自變量，根據(jù)回歸系數(shù)符號性質(zhì)和大小確定該組分在配方中的貢獻是正面還是負面，以及貢獻的大小。4展望當前昆蟲對引誘性信息化合物的識別逐漸深入到細胞、神經(jīng)元、基因等微觀層次，植物源害蟲引誘劑篩選出的單體成分越來越多，但在農(nóng)業(yè)害蟲防治實踐中可用的引誘劑配方非常少，對昆蟲識別植物揮發(fā)物的嗅覺機理仍然是一知半解的。其中的關鍵在于我們應當如何看待植物揮發(fā)物的“化學指紋圖”。如果總是用“整體論”的觀點去解釋昆蟲與植物的化學通訊，是現(xiàn)代以分析為主導思想的實驗科學精神不能接受的，必須采用適當?shù)姆绞饺シ纸膺@個整體，并且反過來將構成這個整體的子系統(tǒng)重新整合在一起能夠再現(xiàn)引誘作用發(fā)生的自然現(xiàn)象。然而，當前的電生理技術和色譜分析有可能分別過度分解了昆蟲的嗅覺系統(tǒng)和植物的揮發(fā)物譜，造成子系統(tǒng)重組的極大困難。配方均勻設計是解決從行為測試到大田實踐應用的必由之路。參考文獻(References)AllmannS,Sp?theA,Bisch-KnadenS,KallenbachM,ReineckeA,SachseS,BaldwinIT,HanssonBS,2013.Feeding-inducedrearrangementofgreenleafvolatilesreducesmothoviposition.eLife,2:e00421.doi:10.7554/eLife.00421vonArxM,Schmidt-BüsserD,GuerinPM,2012.Plantvolatilesenhancebehavioralresponsesofgrapevinemothmales,Lobesiabotranatosexpheromone.J.Chem.Ecol.,38(2):222–225.BecherPG,BengtssonM,HanssonBS,WitzgallP,2010.Flyingthefly:long-rangeflightbehaviorofDrosophilamelanogastertoattractiveodors.J.Chem.Ecol.,36(6):599–607.BruceTJ,CorkA,HallDR,DunkelblumE,2002.LaboratoryandfieldevaluationoffloralodoursfromAfricanmarigold,Tageteserecta,andsweetpea,Lathyrusodoratus,askairomonesforcottonbollwormHelicoverpaarmigera.IOBCWprsBull.,25:315–322.CarlssonMA,HanssonBS,2003.Dose-responsecharacteristicsofglomerularactivityinthemothantennallobe.Chem.Sens.,28(4):269–278.CookSM,KhanZR,PickettJA,2007.Theuseofpush-pullstrategiesinintegratedpestmanagement.Annu.Rev.E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