雷帕霉素促進(jìn)自噬并降低神經(jīng)組織損傷和脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能障礙摘要:哺乳動(dòng)物雷帕霉素的受體(mTOR)是負(fù)向調(diào)節(jié)自噬的絲氨酸/蘇氨酸激酶。雷帕霉是mTOR信號(hào)抑制劑，可以促進(jìn)自噬并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的幾種疾病中起到神經(jīng)保護(hù)作用。在本研究中，我們評估了小鼠脊髓損傷(SCI)后，應(yīng)用雷帕霉素是否促進(jìn)自噬，并降低神經(jīng)組織損傷和減少運(yùn)動(dòng)功能障礙。我們的結(jié)果表明雷帕霉素的應(yīng)用大大減少了損傷脊髓組織中p70S6K蛋白質(zhì)的磷酸化以及LC3和Beclin1的高表達(dá)。此外，損傷脊髓組織中，雷帕霉素組的神經(jīng)元丟失和細(xì)胞死亡率明顯低于溶劑對照組。并且，在大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評分--（BMS評分）中，雷帕霉素處理組得分明顯高于溶劑對照組。這些結(jié)果表明，脊髓損傷后，雷帕霉素通過抑制mTOR信號(hào)通路，提高自噬水平，并減少神經(jīng)組織損傷和運(yùn)動(dòng)功能障礙。脊髓損傷后應(yīng)用雷帕霉素治療可能成為一種新的治療策略。關(guān)鍵詞：自噬；Beclin1；LC3；

雷帕霉素靶蛋白；雷帕霉素；脊髓損傷前言：雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類藥物，最初被用作抗真菌劑。雷帕霉素是一種特殊的哺乳動(dòng)物雷帕霉素受體阻滯劑(Ravikumaretal.,2004;SchmelzleandHall,2000)。它結(jié)合于胞質(zhì)的FK結(jié)合蛋白(FKBP12)。雷帕霉素-FKBP12復(fù)合物抑制mTOR，阻止p70S6K和4EBP1的磷酸化(Vignotetal.,2005)。因此，雷帕霉素抑制mTOR從而促進(jìn)自噬(Kamadaetal.,2004;KlionskyandEmr,2000;SchmelzleandHall,2000;WangandKlionsky,2003)。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的分解代謝的機(jī)制，通過自噬溶酶體途徑降解細(xì)胞質(zhì)成分(Mizushima,2004)。這種機(jī)制對維持穩(wěn)態(tài)起著重要的作用，在某些疾病中起到保護(hù)作用(Haraetal.,2006;Liangetal.,1999;Ru-binszteinetal.,2005;ShintaniandKlionsky,2004)。自噬在細(xì)胞生長和應(yīng)激狀態(tài)下清除或者再利用長壽蛋白和受損的細(xì)胞器(LevineandKlionsky,2004;ShintaniandKlionsky,2004)。已有研究表明，自噬對正常細(xì)胞的生長，分化和存活也很重要(ReggioriandKlionsky,2002;SchmelzleandHall,2000)。新近研究表明，應(yīng)用雷帕霉素能夠增強(qiáng)自噬，在亨廷頓病和帕金森病等某些神經(jīng)退行性疾病中能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞(Malageladaetal.,2010;Ravikumaretal.,2004)。在這些退行性疾病中，應(yīng)用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬能夠增強(qiáng)對聚集蛋白的清除從而減少其毒性(Bergeretal.,2006;Webbetal.,2003)。以往的研究表明，在創(chuàng)傷性腦損傷和腦缺血后的神經(jīng)組織中自噬活動(dòng)是增強(qiáng)的(Bigfordetal.,2009;Diskinetal.,2005;Ramietal.,2008)。應(yīng)用雷帕霉素增強(qiáng)自噬的活性并降低腦外傷和新生兒缺氧缺血性腦損傷的神經(jīng)組織損傷(Carlonietal.,2008;Erlichetal.,2007a)。一些研究也表明，自體吞噬增強(qiáng)可以減少受中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中受損神經(jīng)細(xì)胞的凋亡(Carlonietal.,2008;Panetal.,2008)。因此，使用雷帕霉素促進(jìn)自噬被認(rèn)為能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起到神經(jīng)保護(hù)功能。我們此前曾報(bào)道，脊髓損傷（SCI）后受損的神經(jīng)組織中自噬活性顯著增強(qiáng)(Kannoetal.,2009b,2011)。然而，在SCI后受損神經(jīng)組織中細(xì)胞自噬的實(shí)際功能目前還不清楚(Kannoetal.,2009c)。此外，雷帕霉素治療是否能促進(jìn)細(xì)胞自噬和誘導(dǎo)脊髓損傷后受損的神經(jīng)組織的神經(jīng)保護(hù)功能仍有待闡明。本研究的目的是，應(yīng)用脊髓損傷小鼠模型，檢測脊髓損傷后應(yīng)用雷帕霉素治療是否抑制mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞自噬。我們還研究了脊髓損傷后，應(yīng)用雷帕霉素治療是否可降低脫髓鞘，神經(jīng)元減少和細(xì)胞死亡等神經(jīng)組織損傷，以及是否提高運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。我們在這里展示，在損傷的脊髓組織應(yīng)用雷帕霉素治療可通過抑制mTOR通道顯著提高自噬活動(dòng)。此外，雷帕霉素顯著減少脊髓損傷后的神經(jīng)組織損傷和提高運(yùn)動(dòng)功能。因此，應(yīng)用雷帕霉素可能是一種新的治療脊髓損傷的策略。方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所有的實(shí)驗(yàn)程序，通過日本東北大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有的努力都是盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量，并在研究中盡可能地減少動(dòng)物的痛苦。共58只成年C57BL/6J雌性鼠（10-12周齡）用于本實(shí)驗(yàn)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組實(shí)驗(yàn)用四個(gè)或五個(gè)動(dòng)物。老鼠在24℃脊髓挫傷模型將1.25％氟烷混合于氧/氧化亞氮（30/70％）的混合氣體中麻醉小鼠。手術(shù)過程中，通過一個(gè)加熱墊監(jiān)測和維持直腸溫度在37.0±0.5℃。脊柱區(qū)皮膚去毛并用消毒液清洗。沿中線切開皮膚15毫米，暴露T8到T12的椎板。在T10行椎板切除術(shù)，露出帶完整硬腦膜的背部脊髓。脊柱用互成角度的夾子夾住T8和T12的橫突一保持穩(wěn)定。脊髓損傷的模型制作應(yīng)用改良的紐約大學(xué)脊髓打擊器(Bassoetal.,1996;Gruner,1992;Hashimotoetal.,2007;Kannoetal.,2009a;Kimetal.,2001;Okadaetal.,2004)。重量10g的打擊棒（頂端直徑1.5mm）從3mm雷帕霉素的制備和用藥雷帕霉素（Calbiochem公司）溶解在二甲基亞砜（DMSO）（25毫克/毫升）中，并進(jìn)一步稀釋在0.5毫升含有5％的聚乙二醇400和5％的失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚（Tween80簡稱乳化劑T-80）的水溶液中，配制后立即注射。SCI4小時(shí)后，雷帕霉素治療組的小鼠，腹腔內(nèi)注射雷帕霉素，劑量為1毫克/公斤體重。對照組小鼠注射等體積的溶劑。行為分析為了評估SCI后的功能，制定了應(yīng)用后肢運(yùn)動(dòng)功能評分（BMS）的等級(jí)評定表(Bassoetal.,2006;Engesser-Cesaretal.,2005)。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是專門為小鼠制定的，因?yàn)樾∈笈c大鼠的運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的特性是不同的。我們也分析了BMS的分項(xiàng)分?jǐn)?shù)，因?yàn)橐恍﹦?dòng)物可以改善某方面的運(yùn)動(dòng)功能，而不遵循典型的模式恢復(fù)，并因此不會(huì)反映在BMS總得分上(Bassoetal.,2006)。在手術(shù)前，將小鼠單獨(dú)放置在一個(gè)設(shè)定的開放的塑料區(qū)域4分鐘，以確保所有實(shí)驗(yàn)對象獲得最大得分值。小鼠被放置在開放的領(lǐng)域，受過訓(xùn)練研究員以雙盲的方式評測小鼠的的BMS分值。在SCI后4h和24h，3，7，14，21，28，35，和42天測得BMS分值。Westernblot檢測在SCI后24小時(shí)或3天處死小鼠，取出脊髓組織。脊髓放于裂解緩沖液中，裂解液包括50mMTrisHCl（pH值7.6），20mM氯化鎂，150mM的NaCl，0.5％的Triton-X，5單位/毫升抑肽酶，5微克/毫升亮肽素，5微克/mL胃酶抑素，1mM芐脒，1mM苯甲磺酰氟。離心去除殘余脊髓組織，根據(jù)BioRad蛋白濃度測定手冊測定溶解液中的蛋白水平(Bio-RadLaboratories,GmbH,Munich,Ger-many)。溶胞產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)，在15％凝膠上通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離，然后電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。對膜進(jìn)行封閉1h在TBST緩沖液中（pH為7.5的0.01M的Tris鹽酸，0.15MNaCl和0.05％吐溫20）含有3％的牛奶，和孵育兔抗hosphop70S6K的抗體（1:1000，CellSignaling公司），兔抗-LC3的抗體（1:500;MBL）或稀釋的兔抗-Beclin1的抗體（1:100，SantaCruzBiotechnology公司），在4℃下，TBST緩沖液中過夜。將膜洗滌三次，并在室溫下放于與辣根過氧化物酶（1:1000;Invitrogen公司）結(jié)合的二抗中孵育1小時(shí)。免疫反應(yīng)的條帶，應(yīng)用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑（Amersham公司）和數(shù)字化的LAS-1000Pro（FUJIFILM，東京，日本）顯影。應(yīng)用掃描密度分析和圖像J1.42q軟件程序?qū)Χ織l帶的密度（美國國立衛(wèi)生研究院）。用β組織制備脊髓損傷后3天及42天，向小鼠腹腔內(nèi)過量注射100毫克/公斤的戊巴比妥鈉。小鼠穿心灌注生理鹽水，然后置于由4％的多聚甲醛和0.1M磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）混合的pH7.4混合液中。用于免疫組化染色的脊髓節(jié)段，含損傷部位一起收集后固定在相同的固定液中4℃免疫組織化學(xué)免疫組化染色檢測LC3和自噬基因Beclin1使用SCI3天后的切片。切片脫蠟后再水化，然后在PBS中洗滌10分鐘，然后用PBS含有0.3％聚氧乙烯去水山梨醇洗滌10分鐘，，并用含3％的乳劑和5％牛胎兒血清（FBS）的0.01M的PBS沖洗2小時(shí)。切片置于PBS稀釋的兔抗-LC3的抗體（1:100;MBL），兔抗-Beclin1的抗體（1:100;圣克魯斯生物公司）或鼠標(biāo)的anti-NeuN抗體（1:100，Chemicon公司）中4℃過夜。用PBS沖洗后，將切片與山羊抗兔IgG的AlexaFluor594二抗（1:500，MolecularProbes公司）或山羊抗小鼠IgG的AlexaFluor488的二抗（1:500，MolecularProbes公司）中，在室溫下孵育1小時(shí)。切片包埋于含DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的VectashieldLC3陽性細(xì)胞和Beclin1的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫組織化學(xué)染色LC3和自噬基因Beclin1后對每個(gè)切片均使用激光顯微鏡（(BX51;Olympus,Tokyo,Japan)）掃描。切片的掃描圖像在含有網(wǎng)格的6.0版本的PhotoshopElements軟件程序監(jiān)視器上顯示。然后使用手動(dòng)的計(jì)數(shù)器對LC3陽性細(xì)胞和Beclin1陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。LC3-陽性細(xì)胞被定義為這些顯示點(diǎn)狀LC3的熒光點(diǎn)(Kabeyaetal.,2000;Ramietal.,2008)。對打擊中心部位以及頭側(cè)250微米和尾側(cè)500微米部位的切片進(jìn)行LC3-陽性細(xì)胞和Beclin1的陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)。雷帕霉素處理組，溶劑處理組與假手術(shù)對照組之間分別比較五個(gè)部位切片的細(xì)胞計(jì)數(shù)量。白質(zhì)染色SCI后42天取脊髓打擊中心250微米處的脊髓組織切片，將這些7微米厚的切片行脊髓luxol

fastblue染色。luxol

fastblue染色最輕的部分被作為損傷中心。一共有9個(gè)連續(xù)的部分，橫跨2000微米脊髓長度，其中評估了包括打擊中心頭側(cè)和尾側(cè)各四個(gè)切片。染色切片的圖像由數(shù)字照相機(jī)捕獲，并使用圖像j1.42q軟件程序分析白質(zhì)區(qū)的脊髓。進(jìn)行l(wèi)uxolfastblue染色后，白質(zhì)出現(xiàn)暗的藍(lán)色和與健康的神經(jīng)組織相同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。損壞或退化的白質(zhì)變得蒼白或被有明顯的嗜堿性核細(xì)胞群的瘢痕組織取代(Baoetal.,2011;JoshiandFehlings,2002;Stewardetal.,1999)。我們對雷帕霉素處理組和賦形劑處理組的白質(zhì)區(qū)分別進(jìn)行了分析。TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)為了檢測由細(xì)胞死亡引起的脊髓損傷的DNA片段，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色，應(yīng)用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司，德國曼海姆）對傷后3天的橫截面脊髓切片進(jìn)行檢測。用BX51顯微鏡掃描損傷中心頭側(cè)和尾側(cè)250微米處標(biāo)記的切片。對每個(gè)部分中的TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。TUNEL陽性細(xì)胞被定義為用TUNEL和DAPI雙標(biāo)記的細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)過程是相同的，以前所描述的。對雷帕霉素處理組和溶劑處理組中每個(gè)動(dòng)物三個(gè)部分中的細(xì)胞計(jì)數(shù)均進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)分析LC3-陽性細(xì)胞，Beclin1-陽性細(xì)胞，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量有顯著差異，Western印跡分析得到的條帶，均使用配對t檢驗(yàn)。采用Mann-Whitney'sU檢驗(yàn)對每個(gè)時(shí)間點(diǎn)BMS得分的差異進(jìn)行檢驗(yàn)。在所有的分析，p值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPadPrism5.0a的軟件程序(GraphPadSoftware,Inc.LaJolla,CA)。結(jié)果：BMS運(yùn)動(dòng)功能評分為了評估雷帕霉素治療脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響，測量了6個(gè)星期的BMS總分和單項(xiàng)分(Fig.1AFIG.1.Ａ，Ｂ?lián)p傷后14天到42天，雷帕霉素治療的小鼠的BMS的總分?jǐn)?shù)的平均值始終高于溶劑對照組的。損傷后21天到42天，雷帕霉素治療的小鼠的BMS分?jǐn)?shù)顯著高于溶劑對照組。損傷42天后，雷帕霉素治療的小鼠的BMS總分值的得分為7-9（8.4±0.4）。42天的時(shí)候，除一組雷帕霉素處理的小鼠BMS為7分外，其他四個(gè)雷帕霉素治療組小鼠均達(dá)到協(xié)調(diào)步態(tài)，或者有輕微的不穩(wěn)。另一方面，溶劑處理組的小鼠的BMS分?jǐn)?shù)分別為5-8（6.8±0.5）。五分之四溶劑處理組的小鼠行進(jìn)時(shí)不能保持足部平行，或者表現(xiàn)出嚴(yán)重的軀干不穩(wěn)定，如傾斜，蹣跚，或傾倒。雷帕霉素處理組和溶劑處理組小鼠的BMS單項(xiàng)得分在損傷24h后均增加，并在損傷后28天達(dá)到了平臺(tái)。損傷后14天至42天，雷帕霉素處理組BMS單項(xiàng)得分平均始終高于溶劑處理組。損傷后14天至42天，雷帕霉素處理組BMS總得分明顯高于溶劑處理組。p70S6K的磷酸化為了研究mTOR信號(hào)通路在小鼠體內(nèi)的雷帕霉素治療的有效性，應(yīng)用Westernblotp對70S6K的磷酸化進(jìn)行分析評價(jià)。傷后24小時(shí)到3天，雷帕霉素處理組p70S6K蛋白的磷酸化較溶劑處理組和假手術(shù)對照組有所減少(Fig.2A)。Fig.2A基于頻帶密度分析，在損傷后24h，雷帕霉素處理組（2.318±0.866）p70S6K的磷酸化水平顯著低于溶劑對照組（8.773±1.083），和假手術(shù)對照組（10.000±1.794）（分別取P值=0.002和0.005）(Fig.2B)。Fig.2損傷后第3天，三組間p70S6K的磷酸化水平，沒有表現(xiàn)出任何統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異。LC3表達(dá)的免疫組化和Westernblot分析為了檢測雷帕霉素治療后的自噬活性，對LC3進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并對LC3-陽性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。與假手術(shù)對照組相比，雷帕霉素處理組和溶劑對照組的小鼠細(xì)胞LC3的表達(dá)量增加(Fig.3A–I,S)。雷帕霉素處理組的小鼠表達(dá)LC3的細(xì)胞數(shù)量明顯高于溶劑處理組。高倍顯微鏡顯示，表達(dá)LC3的細(xì)胞中顯示的點(diǎn)狀LC3的位于細(xì)胞質(zhì)中(Fig.3J–R)。與假手術(shù)對照組相比，雷帕霉素處理組和溶劑處理組小鼠LC3-陽性細(xì)胞的數(shù)目顯著增加（分別為P值=0.012和<0.001）。此外，雷帕霉素處理組LC3-陽性細(xì)胞數(shù)目顯著高于溶劑處理組(p=0.018)(Fig.3T)。在Western印跡分析中，雷帕霉素處理組LC3-II的蛋白的表達(dá)高于與賦形劑處理組和假手術(shù)對照組(Fig.4A)。在條帶分析中，雷帕霉素處理組（7.274±0.783）LC3-II的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)對照組（1.000±0.380）和賦形劑處理組小鼠（4.717±0.532）（分別取P值=0.002和0.001）。此外，雷帕霉素處理組LC3-II的表達(dá)顯著高于賦形劑處理組（p值=0.035）(Fig.4B)。Fig.３Fig.4Beclin1表達(dá)的免疫組化和Westernblot分析為了研究自噬活性，我們也對Beclin1的表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢測，并計(jì)數(shù)Beclin1的陽性細(xì)胞。與假手術(shù)對照組相比，雷帕霉素處理組和溶劑對照組小鼠表達(dá)Beclin1的細(xì)胞數(shù)明顯增加(Fig.5A–I,S)。與假手術(shù)對照組相比，雷帕霉素處理組和溶劑對照組小鼠Beclin1陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加（分別取p值=0.005，和<0.001）(Fig.5T)。Western印跡分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)對照組相比，雷帕霉素處理組和溶劑對照組小鼠細(xì)胞表達(dá)Beclin1蛋白的量顯著增加(Fig.6A,B)。條帶密度分析顯示，與假手術(shù)對照組（1.000±0.594）相比，雷帕霉素處理組（7.411±0.882）和溶劑對照組（6.506±0.609）小鼠細(xì)胞表達(dá)Beclin1蛋白的量顯著增加（分別取p值<0.001和0.001）。此外，與假手術(shù)對照組相比，雷帕霉素處理組Beclin1的表達(dá)相對較高，但沒有顯著增加。Fig.5FIG.6.未受損白質(zhì)區(qū)為了研究脊髓損傷后不同損傷區(qū)脫髓鞘作用的不同，對雷帕霉素處理組和溶劑處理組的未受損白質(zhì)區(qū)使用luxolfast藍(lán)染色進(jìn)行對比。雷帕霉素處理組未受損白質(zhì)區(qū)范圍明顯大于溶劑處理組，正如應(yīng)用luxolfast藍(lán)染色對損傷周圍切片染色的結(jié)果所示(Fig.7A,B)。雷帕霉素處理組白質(zhì)區(qū)受保護(hù)程度高于溶劑處理組，特別是在背側(cè)的脊髓(Fig.7B)。對未受損白質(zhì)區(qū)的定量分析顯示，在受損傷中心頭Fig.7A,B端和尾端>500微米的范圍，雷帕霉素處理組未受損白質(zhì)區(qū)的平均值雖不是顯著大于溶劑處理組但始終高于溶劑處理組(Fig.7C)。Fig.7CNeuN陽性細(xì)胞數(shù)為了研究損傷后的神經(jīng)細(xì)胞損失，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法對雷帕霉素處理和溶劑處理組NeuN陽性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行比較。溶劑處理組NeuN陽性細(xì)胞的數(shù)目稀少。相反，與溶劑處理組相比，雷帕霉素處理的小鼠NeuN陽性細(xì)胞的數(shù)目更高(Fig.8A–M)。脊髓損傷后42天內(nèi)，雷帕霉素處理的小鼠NeuN-陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著高于溶劑對照組（p值=0.012）(Fig.8N)。Fig.8TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)為了探討脊髓損傷后，雷帕霉素對細(xì)胞死亡中的效應(yīng)，我們進(jìn)行TUNEL染色，并對雷帕霉素處理組和溶劑處理組小鼠TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行比較。在傷后3天獲得的切片TUNEL染色中發(fā)現(xiàn)，與賦形劑處理的小鼠相比，雷帕霉素處理的小鼠TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少(Fig.9A–M)。對TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，與賦形劑處理的小鼠相比，雷帕霉素處理的小鼠TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少(p=0.008)(Fig.9N)。Fig.9討論：在本研究中，我們證實(shí)了雷帕霉素的應(yīng)用顯著降低了損傷脊髓組織中p70S6K的磷酸化以及LC3和Beclin1的高表達(dá)。此外，與溶劑處理組相比，雷帕霉素處理組小鼠的受損脊髓組織中神經(jīng)元丟失和細(xì)胞死亡顯著減少。此外，雷帕霉素處理過的小鼠運(yùn)動(dòng)功能的BMS評分明顯高于溶劑處理組小鼠。這些結(jié)果表明，SCI后，應(yīng)用雷帕霉素抑制mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提高自噬水平，減少了神經(jīng)組織損傷和運(yùn)動(dòng)功能受損。本研究表明，雷帕霉素對脊髓損傷后的神經(jīng)具有保護(hù)作用。以往的研究表明，在多種神經(jīng)變性疾病中應(yīng)用雷帕霉素抑制mTOR信號(hào)通路，將激活細(xì)胞自噬(Panetal.,2008;Ravikumaretal.,2004)。此外，在創(chuàng)傷性腦損傷和新生兒缺氧缺血性腦損傷中，雷帕霉素能夠增強(qiáng)自噬活性(Carlonietal.,2008;Erlichetal.,2007a)。這些數(shù)據(jù)表明，，雷帕霉素通過抑制mTOR提高細(xì)胞自噬活性。在本研究中，在受損脊髓損組織中應(yīng)用雷帕霉素顯著減少了p70S6K蛋白的磷酸化。p70S6K磷酸化的減少表明，脊髓損傷后應(yīng)用雷帕霉素實(shí)際上是抑制了mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路。我們的研究結(jié)果還表明，脊髓損傷后應(yīng)用雷帕霉素誘導(dǎo)LC3和自噬基因Beclin1的上調(diào)。這些研究結(jié)果表明，在脊髓損傷后的病變部位雷帕霉素通過抑制mTOR信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞自噬。自噬活動(dòng)是受不同的分子調(diào)控，包括mTOR，自噬基因Beclin1，Bcl家族基因，DRAM，P53和NF-

κB(Maiurietal.,2007;Scarlattietal.,2009)。此前有研究表明，自噬基因Beclin1不僅調(diào)節(jié)自噬活動(dòng)，也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的死亡機(jī)制(Maiurietal.,2007)。Beclin1的與Bcl-2交互作用，這是已知的抗凋亡蛋白(Erlichetal.,2007b)。因此，Beclin1的表達(dá)水平，不直接指示自噬活動(dòng)的水平。在這項(xiàng)研究中，LC3的表達(dá)，作為細(xì)胞自噬的標(biāo)記，SCI后應(yīng)用雷帕霉素后顯著增加。然而，雷帕霉素治療后，Beclin1表達(dá)沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的增加。這些結(jié)果提示，SCI后應(yīng)用雷帕霉素治療激活自噬后沒有直接導(dǎo)致Beclin1的表達(dá)上調(diào)。雷帕霉素通過抑制mTOR可以導(dǎo)致有利或不利的影響，這取決于疾病的模型和發(fā)病時(shí)間。以往的研究表明，雷帕霉素治療加重腎缺血/再灌注損傷(Gonc?alvesetal.,2007;Luietal.,2006)。雷帕霉素阻斷局部缺血或藥物預(yù)調(diào)節(jié)對心肌梗死的心肌保護(hù)作用(Jonassenetal.,2001;Kisetal.,2003)。另一方面，雷帕霉素治療具有細(xì)胞保護(hù)作用，包括減少心肌梗死面積，降低心肌缺血/再灌注損傷引起的細(xì)胞死亡(Khanetal.,2006)。雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，也能夠在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病種產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)功能。以往的研究表明，應(yīng)用雷帕霉素能修復(fù)救亨廷頓氏病和帕帕金森氏病模型中的神經(jīng)細(xì)胞(Malageladaetal.,2010;Ravikumaretal.,2004)。有趣的是，雷帕霉素治療可減少創(chuàng)傷性腦損傷以及新生兒缺血缺氧性腦損傷導(dǎo)致的神經(jīng)組織受損(Carlonietal.,2008;Erlichetal.,2007a)。在本研究中，雷帕霉素減少脊髓損傷后的神經(jīng)元的損失。此外，雷帕霉素治療的小鼠有更高的運(yùn)動(dòng)功能BMS分值。本研究表明，應(yīng)用雷帕霉素可以通過減少神經(jīng)組織損傷和促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)對脊髓損傷后的神經(jīng)組織起到保護(hù)作用。雷帕霉素具有細(xì)胞保護(hù)作用，歸因于其阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Carlonietal.,2008;Khanetal.,2006;Panetal.,2008)。有人認(rèn)為，雷帕霉素通過自噬提高了線粒體的清除率，從而降低胞漿細(xì)胞色素c釋放和下游的激酶的激活(Ravikumaretal.,2006)。以往的研究表明雷帕霉素通過減少細(xì)胞凋亡在各種疾病模型中具有細(xì)胞保護(hù)功能。例如，在心肌缺血再灌注模型中，雷帕霉素顯著降低了心肌組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量(Khanetal.,2006)。在乳胞素誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病模型中，雷帕霉素促進(jìn)自噬和抑制細(xì)胞凋亡(Panetal.,2008)。雷帕霉素激活的細(xì)胞自噬也降低了新生兒缺氧缺血性腦損傷模型中活化caspase-3的表達(dá)(Carlonietal.,2008)。有趣的是，在這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的模型中，自噬的活性的上調(diào)沒有應(yīng)用雷帕霉素，但應(yīng)用雷帕霉素使其進(jìn)一步增強(qiáng)(Carlonietal.,2008;Panetal.,2008)。這些報(bào)告表明，雷帕霉素治療，進(jìn)一步促進(jìn)自噬活動(dòng)，并加強(qiáng)其細(xì)胞保護(hù)功能，以減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病中的細(xì)胞死亡。在本研究中，雷帕霉素進(jìn)一步推動(dòng)了SCI后自噬活動(dòng)的上調(diào)。此外，在SCI3天之后雷帕霉素治療顯著減少TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。這些結(jié)果表明，在SCI后受損神經(jīng)組織中，雷帕霉素治療增強(qiáng)了自噬的活性，從而阻止細(xì)胞死亡。在這項(xiàng)研究中，雷帕霉素的應(yīng)用在SCI后4小時(shí)單次注射。許多先前的研究表明，雷帕霉素在體內(nèi)的半衰期相對較長（33-63ｈ）(Chenetal.,2007;Napolietal.,1997)。事實(shí)上，一些報(bào)告表明，單次給予雷帕霉素可能會(huì)影響自噬活性和細(xì)胞死亡長于24小時(shí)(Carlonietal.,2008;Shengetal.,2010)。在本研究中，在損傷后4小時(shí)的單次給藥實(shí)際上抑制mTOR信號(hào)通路中p70S6K的磷酸化的作用是在損傷后24小時(shí)，并顯著的降低經(jīng)元丟失和細(xì)胞死亡的程度。這些結(jié)果表明，在損傷后4小時(shí)應(yīng)用雷帕霉素治療可以減少SCI后24小時(shí)至3天的繼發(fā)性損傷(Beattieetal.,2000;Yongetal.,1998)。本研究表明，在病變部位應(yīng)用雷帕霉素具有細(xì)胞保護(hù)作用。因此，應(yīng)用雷帕霉素是一種新的治療手段，以期減少脊髓損傷后繼發(fā)性損傷。最近的研究已經(jīng)表明，通過雷帕霉素抑制mTOR可以抑制受損神經(jīng)組織再生。雷帕霉素阻斷mTOR可抑制axonotomy后生長錐再生(Vermaetal.,2005)。應(yīng)用雷帕霉素可減少腺苷-5'-三磷酸腺苷（ATP）介導(dǎo)的軸突再生(Huetal.,2010)。雷帕霉素降低由磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）的缺失介導(dǎo)的神經(jīng)軸突再生的能力(Parketal.,2008)。這些研究表明，雷帕霉素抑制mTOR，抑制蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖，促進(jìn)軸突再生。另一方面，一些報(bào)告表明，雷帕霉素能促進(jìn)特定環(huán)境下神經(jīng)的再生。雷帕霉素治療可以降低脊髓缺血模型病變部位膠質(zhì)細(xì)胞增生(Codeluppietal.,2009)。雷帕霉素激活細(xì)胞自噬可以提高脫髓鞘神經(jīng)病變模型種髓鞘的形成(Rangarajuetal.,2010)。在這項(xiàng)研究中，雷帕霉素通過抑制mTOR顯著降低了SCI急性損傷期神經(jīng)組織的損傷和運(yùn)動(dòng)功能障礙。因此，在SCI急性損傷期應(yīng)用雷帕霉素可以起到細(xì)胞保護(hù)作用，并減少繼發(fā)性損傷。進(jìn)一步的研究可以闡明雷帕霉素在神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生中的作用，并揭示脊髓損傷的一種新的治療策略。致謝：本項(xiàng)研究由日本學(xué)術(shù)振興會(huì)名下的格蘭特急救科學(xué)研究所（第19591712號(hào)），和日本矯形外科及創(chuàng)傷基金公司（第0138號(hào)），以及在2007年從日本保險(xiǎn)行業(yè)協(xié)會(huì)獲權(quán)的格蘭特的支持。我們感謝KoshiN.Kishimoto博士給予的有益的探討。我們也感謝KAT-suyoshi先生的技術(shù)援助，感謝TerukoSueta女士和東北大學(xué)動(dòng)物研究所動(dòng)物醫(yī)療團(tuán)隊(duì)在這項(xiàng)研究中所做的動(dòng)物保健工作。作者披露聲明：無競爭性財(cái)政利益。參考文獻(xiàn)：Bao,F.,Fleming,J.C.,Golshani,R.,Pearse,D.D.,Kasabov,L.,Brown,A.,andWeaver,L.C.(2011).ASelectivePhospho-diesterase-4InhibitorReducesLeukocyteInfiltration,Oxida-tiveProcesses,andTissueDamageafterSpinalCordInjury.J.Neurotrauma.28:(Epubaheadofprint).Basso,D.,Beattie,M.,andBresnahan,J.(1996).Gradedhisto-logicalandlocomotoroutcomesafterspinalcordcontusionusingtheNYUweight-dropdeviceversustransection.Exp.Neurol.139,244–256.Basso,D.,Fisher,L.,Anderson,A.,Jakeman,L.,McTigue,D.,andPopovich,P.(2006).BassoMouseScaleforlocomotiondetectsdifferencesinrecoveryafterspinalcordinjuryinfivecommonmousestrains.J.Neurotrauma.23,635–659.Beattie,M.S.,Farooqui,A.A.,andBresnahan,J.C.(2000).Reviewofcurrentevidenceforapoptosisafterspinalcordinjury.J.Neurotrauma.17,915–925Berger,Z.,Ravikumar,B.,Menzies,F.,Oroz,L.,Underwood,B.,Pangalos,M.,Schmitt,I.,Wullner,U.,Evert,B.,O’Kane,C.,andRubinsztein,D.(2006).Rapamycinalleviatestoxicityofdifferentaggregate-proneproteins.Hum.Mol.Genet.15,433–442.Bigford,G.E.,Alonso,O.F.,Dietrich,D.,andKeane,R.W.(2009).AnovelproteincomplexinmembraneraftslinkingtheNR2Bglutamatereceptorandautophagyisdisruptedfollowingtraumaticbraininjury.J.Neurotrauma.26,703–720.Carloni,S.,Buonocore,G.,andBalduini,W.(2008).Protectiveroleofautophagyinneonatalhypoxia-ischemiainducedbraininjury.Neurobiol.Dis.32,329–339.Chen,Y.W.,Smith,M.L.,Sheets,M.,Ballaron,S.,Trevillyan,J.M.,Burke,S.E.,Rosenberg,T.,Henry,C.,Wagner,R.,Bauch,J.,Marsh,K.,Fey,T.A.,Hsieh,G.,Gauvin,D.,Mollison,K.W.,Carter,G.W.,andDjuric,S.W.(2007).Zotarolimus,anovelsirolimusanaloguewithpotentanti-pr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