飼料對異育銀鯽消化道微生物物種組成的影響,漁業(yè)論文腸道對于動物來講就像是內(nèi)在生命線,而腸道內(nèi)微生物影響著腸道諸多功能的發(fā)揮,因而關(guān)于腸道內(nèi)微生物的研究最近幾年也越來越被重視。已有研究表示清楚,魚類消化道微生物對魚的免疫、營養(yǎng)等都有重要影響,消化道內(nèi)微生物群落的平衡穩(wěn)定能夠促進(jìn)魚體健康的生長。魚類消化道微生物在影響著宿主魚的同時,其組成也受著宿主本身與外界因素的影響,Romero等發(fā)現(xiàn)銀大麻哈魚(Oncorhynchusketa)消化道微生物群落在第一投喂階段后才穩(wěn)定,而李學(xué)梅等對室內(nèi)養(yǎng)殖的斑點叉尾、銀鯽和異育銀鯽的消化道微生物進(jìn)行了比擬,發(fā)現(xiàn)不同種魚的消化道微生物的種類組成有顯著差異,同時尹軍霞等研究發(fā)現(xiàn)同種魚消化道不同區(qū)段的微生物組成也存在很大不同,另外,Margolis早在1952年用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對經(jīng)過饑餓處理的大頭魚(Ameiurusnebulosus)及斑點鱒(Salaelirutsfon-tinali)的消化道細(xì)菌進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)饑餓使消化道微生物種類減少。以上研究表示清楚消化道微生物與宿主魚之間存在密切關(guān)系。對于外界條件變化,消化道微生物本身能否存在響應(yīng)機(jī)制呢？本研究選用消化道微生物群落已相對穩(wěn)定的異育銀鯽中科3號成魚作為研究對象,并將其消化道作為相對封閉的微型生態(tài)系統(tǒng)來研究,旨在進(jìn)一步闡述飼料這一魚類營養(yǎng)源在作為消化道微生態(tài)系統(tǒng)外界干擾時對其內(nèi)部物種組成的影響,為今后研究消化道微生物功能基因指明了方向,同時為水產(chǎn)魚類腸道菌群研究提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1材料與方式方法1.1實驗材料與樣品采集實驗魚飼養(yǎng)于中國科學(xué)院水生生物研究所魚類生理生態(tài)學(xué)學(xué)科組循環(huán)水系統(tǒng)中,水溫為2428℃,期間投喂人工配合飼料,待性成熟后進(jìn)行饑餓處理30d,隨機(jī)抽取3尾同規(guī)格的魚,在編號A、B和C后解剖取樣,取樣時用75%的酒精擦拭腸外壁,分前腸、中腸和后腸取樣,獲得9份樣品分別編號H1-H9(H1、H2、H3代表A的前腸、中腸和后腸,H4-H6及H7-H9對應(yīng)代表B和C的前腸、中腸和后腸),保存用于微生物DNA的提取;再給剩下的魚投喂一樣人工配合飼料,25d后再次隨機(jī)抽取3尾同規(guī)格的魚編號D、E和F,解剖取樣得9份樣品,分別編號F1-F9(F1、F2、F3代表D的前腸、中腸和后腸,F4-F6及F7-F9對應(yīng)代表E和F的前腸、中腸和后腸),保存用于微生物DNA的提取。1.2消化道微生物總DNA的提取實驗采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取腸道微生物總DNA,即:向每管樣品中參加1.2mL裂解液(0.5%SDS;10mmol/LTris-Cl,pH8.0;10mmol/LEDTA,pH8.0;100mmol/LNaCl;蛋白酶K100g/mL;RNaseA,50g/mL),37℃水浴1h后,參加PK(20mg/mL)6L,55℃過夜(12h,至清亮);取上清液進(jìn)行DNA抽提,DNA在4℃下經(jīng)24h沉淀后,離心枯燥并參加100mL無菌水溶解,20℃保存?zhèn)溆?總DNA用0.7%的瓊脂糖凝膠(含EB)進(jìn)行電泳以檢測提取效果。1.3PCR-DGGE分析采用細(xì)菌16SrRNA基因V3區(qū)通用引物(F357-GC和R518)對所得18個樣品中的腸道細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增得產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析,變性劑濃度范圍為40%70%,凝膠在110V下經(jīng)過12h的電泳后紫外照相,由于投喂組F5和F6沒有能得到相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,樣品F5和F6不介入數(shù)據(jù)分析,使用QuantityOne(Bio-RadLaboratories,CA,USA)軟件對譜帶進(jìn)行分析。1.4數(shù)據(jù)分析在得到各泳道及譜帶亮度等具體信息并轉(zhuǎn)化為0/1矩陣后,使用Canoco4.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行CA(Cor-respondenceAnalysis)分析,通過R3.0.0對各泳道數(shù)據(jù)進(jìn)行基于Jaccard指數(shù)的類似性分析并繪制聚類圖,通過MicrosoftExcel2018對譜帶數(shù)量及亮度值進(jìn)行分析并繪圖,同時計算譜帶亮度值的方差值以比擬兩組中各物種分布密度的變異程度大小。2結(jié)果2.1消化道微生物群落PCR-DGGE指紋分析針對細(xì)菌16SrRNA基因進(jìn)行的PCR-DGGE指紋分析共檢測到23條不同的譜帶(圖1),華而不實饑餓組譜帶數(shù)為18條,投喂組譜帶數(shù)為17條,兩組共有譜帶12條,由圖上能夠看出饑餓組特異性譜帶穩(wěn)定且與投喂組存在明顯差異不同,以實驗魚為操作單元，基于全腸微生物種類分布的類似性聚類分析表示清楚(圖2),饑餓組A、B和C聚為一枝,D、F聚為一枝。【圖略】2.2消化道微生物群落構(gòu)造類似性CA結(jié)果顯示除樣品F9外,投喂組(F1-F4,F7,F8)與饑餓處理組(H1-H9)消化道存在明顯差異,投喂組樣品主要存在于第二、三象限,饑餓組主要存在于第一象限,且投喂組各樣品總體聚集較饑餓組更嚴(yán)密(圖3),表示清楚投喂組各樣品間消化道微生物群落種類組成類似性高于饑餓組;為了更直觀的顯示各消化道微生物群落的差異不同,基于Jaccard指數(shù)類似性聚類結(jié)果顯示除F1、F2樣品外,饑餓組和投喂組大部分分別聚為兩大枝(圖4)?！緢D3-4】2.3消化道微生物群落構(gòu)造比擬對兩組樣品中的各個譜帶進(jìn)行比擬顯示,饑餓組擁有譜帶數(shù)為18,投喂組擁有譜帶數(shù)為17,兩對照組共同擁有譜帶B3、B4、B8、B9、B10、B12、B13、B15、B18、B19、B20和B22,共計12條(圖5);華而不實B3、B13、B15和B20在饑餓組和投喂組中出現(xiàn)頻率較高,分別為77.8%與100%、100%與71.4%、77.8%與57.1%、77.8%與71.4%,屬高頻率共有譜帶;結(jié)果還顯示,饑餓組中不存在的譜帶為B11、B14、B16、B17和B21,投喂組中不存在的條帶為B1、B2、B5、B6、B7和B23,兩者存在明顯差異?！緢D5】為更清楚明晰的了解兩組中各譜帶的存在以及分布情況,我們計算并比擬了兩對照組中各條帶的平均亮度,結(jié)果顯示(圖6),投喂組56.5%的譜帶平均亮度大于饑餓組,且投喂組中最大亮度與最小亮度之差(2901.99)遠(yuǎn)大于饑餓組最大亮度與最小亮度之差(1508.55);對兩組方差值進(jìn)行計算,結(jié)果顯示,饑餓組方差值(365.79)小于投喂組方差值(885.67),表示清楚饑餓組各樣品間各微生物分布密度的變異程度小于投喂組?！緢D6】3討論魚類消化道作為一個微型生態(tài)系統(tǒng),其內(nèi)部生活的微生物對營養(yǎng)物質(zhì)有適應(yīng)性反響,同時魚類腸道的生物性構(gòu)造差異為生活于其內(nèi)的微生物造就了不同的生境,這對其內(nèi)微生物分布以及擴(kuò)散有很大的影響。對同一種魚來講,成魚的消化道較幼魚的消化道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,遭到水中微生物以及溫度等的影響較幼魚的小。因而,本研究選用成魚消化道作為研究腸道微型生態(tài)系統(tǒng)的對象,以飼料作為這一微型生態(tài)系統(tǒng)的干擾具有很高的可行性。異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)自1985年由中國科學(xué)院水生生物研究所育成以來,迅速被諸多養(yǎng)殖戶以及群眾接受,而中科3號品系當(dāng)前已成為為我們國家大宗水產(chǎn)養(yǎng)殖品種,對該魚的研究具有很好的實際意義。基于前人的探尋求索,本研究選用了異育銀鯽成魚作為研究對象,用飼料作為干擾因素以探尋求索消化道這一微型生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落對恢復(fù)飼料投喂的響應(yīng)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)充分饑餓后恢復(fù)投喂導(dǎo)致腸道微生物發(fā)生明顯變化,首先是腸道微生物種類數(shù)量下降,并且CA分析顯示投喂組樣品間微生物群落物種組成類似性高于饑餓組,然而Manuel等以為,在宏觀生態(tài)系統(tǒng)中,更多的能量來源能夠支持更多的生物種群的存活,揣測本研究這一結(jié)果可能與Bitry研究有關(guān),飼料等營養(yǎng)物質(zhì)可在一定程度上影響前、中和后腸的差異,盡管恢復(fù)飼料投喂增加了消化道微型生態(tài)系統(tǒng)的能量來源,但相比于空腸,恢復(fù)投喂后,同質(zhì)的飼料充滿了投喂組實驗魚的腸道,在降低了實驗魚前腸、中腸、后腸的生境差異并導(dǎo)致微生物種類的下降,同時還使得使得各腸道樣品之間的總差異減少。在分析比擬了兩組條帶的豐度和亮度后,發(fā)現(xiàn)投喂組樣品平均亮度高于饑餓組樣品平均亮度,表示清楚饑餓后恢復(fù)投喂使得腸道微生物總體分布密度上升。投喂組中最大亮度(B20)與最小亮度(B18)之差(2901.99)遠(yuǎn)大于饑餓組最大亮度(B13)與最小亮度(B4)之差(1508.55),且比照饑餓組方差值(365.79)與投喂組方差值(885.67)表示清楚投喂組腸道樣品中微生物的種間密度差異遠(yuǎn)大于饑餓組,揣測該結(jié)果與Kamada等研究有關(guān)。Kamada等用小鼠研究表示清楚消化道微生物物種間存在生存競爭關(guān)系;本實驗飼料的恢復(fù)投喂在增加了能量來源并使得微生物數(shù)量增加的同時,還使得微生物種間競爭加劇,加速構(gòu)成優(yōu)勢種并導(dǎo)致各微生物密度向兩極分化,微生物物種間競爭強(qiáng)度的增加使得有限的生境內(nèi)能包容的微生物種類數(shù)量減少,這一結(jié)果在宏觀生態(tài)系統(tǒng)研究中也得到證實。伴隨著B20密度在投喂后急劇增加以及B1、B2、B5、B6、B7和B23這五個低亮度條帶的消失,新出現(xiàn)了B11、B14、B16、B17和B21這五個條帶平均亮度較高的譜帶,其代表的是腸道內(nèi)物種的更替,揣測其與飼料中攜帶的微生物有關(guān)。以上研究結(jié)果表示清楚,充分饑餓后恢復(fù)投喂會導(dǎo)致腸道微生物發(fā)生明顯變化,本實驗以恢復(fù)投喂飼料作為這一微型生態(tài)系統(tǒng)的外界干擾,在其帶入新的微生物同時,使得微生物密度增加并導(dǎo)致種間競爭加劇,講明在魚類消化道中存在一個完好的微型生態(tài)系統(tǒng)。本研究為下一步研究這一現(xiàn)象作用機(jī)制能否與微生物或魚腸道本身的功能基因有關(guān)指明了方向,也為研究魚類腸道內(nèi)具有特定功能的菌群奠定了基礎(chǔ)。以下為參考文獻(xiàn):[1]MuellerK,AshC,PennisiE,etal.Thegutmicrobiota[J].Science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