生命科學是以探求生命奧秘為中心課題。蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能。沒有足夠純度的生物大分子，結構與功能的研究就無從談起。必須首先解決生物大分子的制備問題。對獲得的生物大分子進行鑒定。生物化學實驗的目的等酶聯(lián)免疫離心分子生物學技術電泳層析光學生化實驗生物化學實驗的主要技術生化實驗內容安排實驗室實驗內容一實驗16：DEAE纖維素離子交換層析二實驗17：血清-γ球蛋白的提純實驗8：醋酸纖維素薄膜電泳三實驗9：聚丙烯酰胺凝膠電泳四實驗5：蛋白質比色分析、血脂蛋白電泳五實驗5：血糖測定、血脂蛋白電泳六實驗7：酶促反應動力學第一輪實驗本身:實驗室規(guī)則:時間、穿著、

儀器不能亂動、

賠償制度、

整潔、

衛(wèi)生。預習報告、

規(guī)范操作（辨認標簽…）、

如實記錄、

污染物、毒物、廢棄物

（酸堿燒傷大量自來水沖洗）規(guī)則實驗

實驗報告要求：題目，組號實驗目的實驗原理（重點闡述濃縮效應與分子篩效應）實驗記錄：如實記錄實驗結果及結果分析：實事求是討論或小結：實驗九聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質PolyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)

實驗時間安排1安裝垂直板型電泳槽。2分離膠的聚合（10－20min)

過硫酸銨（AP）的配制，由兩位同學操作即可3濃縮膠在紫外線照射的條件下聚合（約40min)

此時間講解凝膠及電泳的相關知識4上樣，電泳（60min)，觀察并思考。

午休5染色脫色觀察結果6結果分析實驗報告實驗前準備清點白磁盤內物品吸球（用于各種吸量管）1電泳槽蓋1樣品槽模板（雙面梳子）1楔形板1配膠用燒杯（50ml）2鐵夾4帶邊條長玻璃板（100×100×2mm）1有機玻璃板1短玻璃板（90×100×2mm）1黑導線（連負極，內槽）1U型硅膠密封條1紅導線（連正極，外槽）1電泳槽1微量加樣器（100μl注射器）1操作前仔細了解注意事項，用過物品后放回原位實驗目的掌握電泳的基本原理。理解并記憶PAGE的基本原理

1）濃縮效應

2）不連續(xù)系統(tǒng)熟悉PAGE操作技術。了解PAGE的優(yōu)點及其廣泛應用電泳指帶電顆粒在電場中向著電性相反的電極方向移動的現象。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。實驗原理在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。在生物科學中，電泳技術廣泛應用于蛋白質、核酸和氨基酸等物質的分離和鑒定。電泳技術實驗原理玻璃板（短）梳子（寬齒）標記線濃縮膠分離膠1cm1.安裝玻板：將洗凈的帶白色邊條的玻板水平放置，將U型硅膠密封條平面（┲）向上正確擺放,再將短玻板蓋在密封條上。2.安裝鐵夾：

4只鐵夾將安裝好的玻板夾好夾子的作用點應與白色邊條重合，下沿的2夾子盡量下移，使玻板能夠直立于實驗臺上。3.標記凝膠長度：插入梳子寬齒（平整面對應高板），在梳齒下緣1cm處作記號，取出梳子。實驗步驟4.按下表配制分離膠（用于1塊膠板）

在小燒杯中按下列順序加入：A液（Tris-HCl）1mlB液（Acr-Bis）2ml蒸餾水1ml0.4％過硫酸銨（現配）5ml前面四項加完后，混勻四甲基乙二胺（TEMED）1滴TEMED是加速劑，加入后很快開始凝固，加完后稍事混勻馬上灌注。總濃度T=28.735％B液，交聯(lián)劑比例C=6.4％分離膠B液（丙烯酰胺）是有毒試劑，操作時小心，切勿接觸皮膚或濺入眼內，操作后注意洗手。每種試劑用相應的吸量管或滴管，不可混用，以避免交叉污染影響實驗結果。（B液有累積性神經毒性，盡量不要接觸到皮膚）5.灌制分離膠

注意：防止氣泡的產生。盡量使膠板上液面平齊成一條線灌制完成后直立于水平處，約15-20分鐘可以聚合標記線分離膠將安裝好的玻板垂直放置將小燒杯里配制好的分離膠（約需要8ml）溶液緩慢加入玻璃板之間直至液面到達標記處聚合時間與室溫和加樣準確度有關6.按下表配制濃縮膠（用于1塊膠板）

小燒杯中按下列順序加入：C液（Tris-HCl）0.4mlD液（Acr-Bis）0.8mlE液0.4ml過硫酸銨0.5ml蒸餾水0.9ml四甲基乙二胺（TEMED）1滴總濃度T=12.5％D液，交聯(lián)劑比例C=3％D液有毒性，盡量不要接觸到皮膚7.灌制濃縮膠分離膠將配好的濃縮膠（約2ml）用燒杯在分離膠上加滿濃縮膠插入寬齒梳子：注意插入梳子時不要帶進氣泡整個裝置在紫外線下照射30分鐘，使?jié)饪s膠充分聚合V帶電粒子的移動速度

Q粒子所帶電荷量

X電場強度

r粒子半徑

η

介質的粘度帶電粒子的運動速度(V)v=QX/6πrη實驗原理遷移率μ

即帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。

μ

＝v/E=Q/6πrηv=QE/6πrη實驗原理影響電泳速度的因素內在因素:樣品自身性質外在因素:電場緩沖液支持介質實驗原理a.電荷b.分子大小c.形狀

v=QX/6πrη

待分離大分子的性質實驗原理

電場（三要素）電流：μ與電流成正比電壓：μ與電壓成正比常壓電泳（100-500V）高壓電泳（2000-10000V）電阻：μ與電阻成反比實驗原理

緩沖液:

PH：離子強度：強度過低，緩沖能力差，難以維持pH恒定，同時樣品擴散嚴重；

強度過高，減緩樣品的遷移率。

為電泳提供了恒定的pH值和適宜的離子強度解離性質解離程度運動方向電荷量一般所用離子強度為0.02-0.2之間實驗原理支持介質吸附:支持介質對樣品的滯留作用,可導致樣品的拖尾。電滲：在電場中液體對固體支持物的相對移動。當電滲方向與電泳方向一致時，會加快顆粒泳動速度；反之，當兩者方向相反時，會減慢顆粒泳動速度。分子篩：是凝膠電泳的一個特性。篩孔越小，則顆粒在移動的過程中所受到的阻力也就越大。

實驗原理電泳分類按支持介質的不同可分為

⑴紙電泳⑵醋酸纖維薄膜電泳⑶瓊脂糖凝膠電泳⑷聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）⑸SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）按支持介質形狀不同可分為⑴薄層電泳；

⑵板電泳；

⑶柱電泳實驗原理

8.配制樣品液

每四組配制一份，再分裝成4小份即可。

1——血清0.2ml2——C液1.0ml3——20%或40%的蔗糖3.0ml4——0.05%溴芬蘭0.4ml

（思考2：為什么加2、3、4這三種液體？）實驗步驟9.安裝電泳槽分離膠濃縮膠聚合完全的凝膠板除去鐵夾子除去密封硅膠條有機玻璃板將玻璃夾板、電泳槽內芯、有機玻璃板（代替另外一套玻璃夾板）、楔形板依次放入電泳槽，固定。注意：玻璃夾板短玻璃側與電泳槽內芯緊密接觸。電泳槽電泳槽內芯卡口楔形板10.加入電極緩沖液在外水槽加電極緩沖液（F液）至槽體一半位置，傾斜槽體輕輕震蕩，使玻璃夾板下延空隙（去除硅膠封條后留下的空隙）中氣泡排出。放正槽體繼續(xù)加入電極緩沖液。內外槽水位均超過短板而低于高版上沿。內外槽緩沖液總量約300ml。內槽負極外槽正極外槽正極電泳儀的使用1.了解該電泳儀的最大允許電壓及電流，在使用過程中不要超過其允許的范圍；2.本次實驗采用穩(wěn)流電泳：1）將電流的旋鈕調至最小值，2）將電壓的旋鈕調至最大值，3.打開電泳儀開關，可觀察到穩(wěn)流的小綠燈是亮的實驗步驟11.上樣上樣體積可以自由選擇，但是不要超出加樣槽；針尖不要扎破膠面；每個人至少練習一次加樣，但是也不必將所有的加樣孔里都加入樣品；建議大家選擇不同的上樣體積，并記錄，這樣觀察結果的時候你會發(fā)現有一個最適加樣體積。實驗步驟12.電泳上樣結束后，將電流調至25mA，此時要觀察2-5分鐘電泳的現象；每發(fā)生一種變化，要記錄時間和現象；10分鐘后再次觀察電泳現象；待某條藍顏色的線條泳動至濃縮膠與分離膠的交界處時，將電流調至30mA。待此條藍顏色的線條泳動至分離膠下緣1cm時，停掉電泳。*電泳過程中要保證電極緩沖液始終沒過矮板；關掉電泳儀時要先把電流旋鈕調至最小值在關開關、拔電源。實驗步驟午休每組必須留一人看電泳；去吃飯的同學要盡快回來，以免錯過某些現象；為了你的健康，請不要在實驗室內吃喝；電泳不等人，所以只有辛苦做電泳的人嘍！13.剝膠與染色

拔下電泳槽楔形插板，戴上一次性手套，取出玻璃板用竹鑷子輕輕撬開兩層玻璃板，在分離膠一角作好標記（如切去一小角）去掉濃縮膠部分用小燒杯棄入垃圾桶中用手和鑷子將分離膠剝離到考馬斯亮藍染色液白瓷盤盤內，染色5分鐘濃縮膠棄分離膠染色考馬斯亮藍燃料盤14.脫色：

將分離膠小心完整地從染色液中移到脫色液內，盡量避免將染色液帶入脫色液中（透明飯盒）在脫色搖床上輕輕搖動，脫色三次，每次10分鐘每次更換新鮮脫色液脫色液每次100ml注意搖床頻率不可過快脫色搖床脫色液觀察結果，記錄實驗結果觀察并記錄結果脫色結束后小心取出凝膠放在短玻璃板上擺正，對照先前所做標記，觀察并記錄電泳結果。畫出電泳圖譜簡圖。標記

點樣線

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清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質示意圖—+聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質區(qū)帶分布示意圖PAGE與醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質比較實驗原理思考題1.為什么在血清樣品中加入“2、3、4”

這三種試劑呢？2.矮板一定要朝向負極側嗎？說說你的道理。3.請畫出帶有負電荷的離子的涌動示意圖。4.你觀察到了哪些電泳現象，可以用你學過的知識簡單解釋一下兒嗎？5.你知道本實驗的F液理論上不能多次重復使用嗎，否則會影響濃縮效果，使分離的效果降低，你能解釋一下嗎？6.課堂上你理解了老師講述的重點了嗎？你覺得本次課對你最大的幫助是什么？你認為還有哪些方面有待于你我共同改進？附錄二：試劑配制

１、A液（Tris－HCl，pH8.9，分離膠緩沖液）量取1NHCl48ml稱取Tris36.6g加水至100ml，用前加TEMED0.3ml。２、B液（分離膠單體交聯(lián)劑）總濃度T=28.735％B液，交聯(lián)劑比例C=6.4％分離膠稱取丙烯酰胺28g，甲叉雙丙烯酰胺0.735g加水至100ml。３、C液（Tris－HCl，pH6.7，濃縮膠緩沖液）量取1NHCl48ml，稱取Tris5.98g加蒸餾水至100ml，用前加TEMED0.6ml。４、D液（濃縮膠單體交聯(lián)劑）總濃度T=12.5％D