細(xì)胞融合技術(shù)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院第十四章細(xì)胞融合（cellfusion）：是指兩個(gè)或更多個(gè)不同細(xì)胞在助融劑的作用下，通過膜融合形成具有新遺傳特性的雜種細(xì)胞的技術(shù)。按照技術(shù)過程的不同，細(xì)胞融合可以分為：細(xì)胞融合；原生質(zhì)體融合；細(xì)胞拆合顯微鏡下細(xì)胞融合過程融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程圖解生物種類細(xì)胞來源成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種細(xì)胞融合成功的例子植物細(xì)胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖細(xì)胞融合的意義理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對(duì)于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)一.免疫學(xué)知識(shí)

人體和動(dòng)物都有免疫系統(tǒng)，包括非特異性免疫和特異性免疫。非特異性免疫主要有宿主的屏障，吞噬細(xì)胞，抗菌物質(zhì)，以及炎癥反應(yīng)。特異性免疫又分為細(xì)胞免疫和體液免疫。概述細(xì)胞免疫

主要是指機(jī)體受到異己物質(zhì)（抗原）的刺激后，一類小淋巴細(xì)胞——依賴胸腺的T細(xì)胞發(fā)生增生，分化，直接攻擊靶細(xì)胞或間接地釋放一些淋巴因子從而使機(jī)體達(dá)到免疫的過程。體液免疫

是當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后，來源于骨髓的小淋巴細(xì)胞——B淋巴細(xì)胞進(jìn)行增生和分化為漿細(xì)胞，進(jìn)而合成各種免疫球蛋白(抗體)，然后在體液中發(fā)揮免疫作用的過程。體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可以被外來的抗原所激活并產(chǎn)生相應(yīng)單一、均勻的特異性抗體，但在體外無法進(jìn)行繁殖和傳代；（短命）

骨髓瘤細(xì)胞在體外具有很強(qiáng)的繁殖能力；（長(zhǎng)命）將二者進(jìn)行細(xì)胞融合，制成雜交瘤細(xì)胞，就可以在體外持續(xù)分泌出成分單一的特異抗體，即單克隆抗體。二.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體長(zhǎng)命分泌抗體短命分泌抗體長(zhǎng)命細(xì)胞融合細(xì)胞融合技術(shù)：1984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)單克隆抗體單克隆抗體是將能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系，而產(chǎn)生的抗體。

由于這種抗體是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的抗體，又是由單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，所以稱為單克隆抗體。特定目標(biāo)抗原脾臟中B淋巴細(xì)胞刺激能分泌針對(duì)于該抗原的特異性抗體一、淋巴細(xì)胞的制備

動(dòng)物免疫B淋巴細(xì)胞大量增殖加強(qiáng)免疫

1.常用的免疫動(dòng)物Balb/c小鼠。

免疫方法常規(guī)免疫法“穩(wěn)妥；優(yōu)勢(shì)克隆”脾內(nèi)一次性免疫法“省時(shí)；省抗原”短程免疫法“省時(shí)”體外免疫法“操作繁瑣”常規(guī)免疫法的免疫途徑

皮下注射腹腔注射靜脈注射第3次免疫：抗原+不加佐劑(皮下注射或靜脈注射)第2次免疫：抗原+福氏不完全佐劑(皮下注射)第1次免疫：抗原+福氏完全佐劑(皮下注射)2.常規(guī)免疫法免疫程序：第4次免疫：抗原+不加佐劑(靜脈注射)采集脾臟細(xì)胞二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)1.細(xì)胞融合脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備：于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期制備聚乙二醇（PEG）細(xì)胞融合：濃度40-50%分子量4000,pH8.0,38℃,1min融合方法:

取適量脾細(xì)胞（1×108）與骨髓瘤細(xì)胞(2×107）進(jìn)行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤希瑫r(shí)間控制在1分鐘以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將聚乙二醇融合液緩緩稀釋。脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞/脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞篩選出不能長(zhǎng)期存活不能長(zhǎng)期存活2.雜交瘤細(xì)胞的篩選：H：次黃嘌呤;A：氨基喋呤;T：胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)

(Hypoxanthineguznine

phosphoribosyl

transferase)次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(TK)(Thymidine

kinase)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)3.HAT培養(yǎng)基篩選原理4.HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞混合液HAT培養(yǎng)基HT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基2weekslater1weeklater（每2-3天換液1/2換液）滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)皿要求：簡(jiǎn)便、快速、敏感;酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫熒光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)三、

抗體的檢測(cè)常用方法：抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標(biāo)儀檢測(cè)技術(shù)原理酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法ELISA法檢測(cè)單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽(yáng)性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。四、克隆化常用克隆化方法：動(dòng)物接種法將穩(wěn)定分泌單抗的細(xì)胞株，通過擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)法利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。五、大規(guī)模培養(yǎng)——批量生產(chǎn)單克隆抗體常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：培養(yǎng)上清中X抗體的檢測(cè)克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)模化培養(yǎng)獲得大量單克隆抗體動(dòng)物免疫細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡無限生長(zhǎng)細(xì)胞分泌X抗體只有雜交瘤細(xì)胞可長(zhǎng)期存活下來BALB/c雜交瘤技術(shù)操作流程圖解第二節(jié)原生質(zhì)體融合技術(shù)一、仙臺(tái)病毒法仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段：①兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚；②在37℃中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；②細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時(shí)需Ca2+和ATP；④融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP。病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下：兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個(gè)細(xì)胞融為一體；進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過程示意圖

優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于

200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml

培養(yǎng)液為1g重)，即成50％PEG溶液。PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50％PEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細(xì)胞。PEG溶液在pH6.0時(shí)細(xì)胞融合率最高。二、聚乙二醇（PEG）法聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過程PEG的作用機(jī)理：Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。

PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點(diǎn)是融合過程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。

聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合步驟（1）將兩種不同親本細(xì)胞各5×l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘；（4）加9ml培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml培養(yǎng)液，分別接種5個(gè)直徑60mm平皿，每個(gè)平皿加培養(yǎng)液至5ml，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）6—24小時(shí)后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。三、電融合法電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害?。谎b置精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。電融合的基本過程：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。

電融合誘導(dǎo)法原理示意圖第三節(jié)雜種細(xì)胞的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。同核細(xì)胞：兩個(gè)相同細(xì)胞的融合體。多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體?；诿溉毕菪图?xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選常用的雜種細(xì)胞篩選方法第四節(jié)細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體一、何謂單克隆抗體？只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology

）。NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

二、雜交瘤技術(shù)的基本原理三、雜交瘤細(xì)胞的制備（一）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）（二）免疫小鼠

免疫程序是取6—8周齡Balb／C雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強(qiáng)免疫一次，3—5天后用于融合。免疫時(shí)是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強(qiáng)弱有關(guān)，以IgG為例，第一次為loog，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對(duì)于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06一1×107。（三）脾細(xì)胞的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細(xì)胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；(5)把細(xì)胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘；(6)離心(800一1000轉(zhuǎn)／分)計(jì)數(shù)、備用。（四）細(xì)胞準(zhǔn)備（1）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，計(jì)數(shù)活力細(xì)胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測(cè)定活力細(xì)胞；（3）按1：5或1：10混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。（五）細(xì)胞融合(1)將1ml40％的PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)／分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細(xì)胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5％CO2，溫箱中37℃培養(yǎng)，24小時(shí)后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。（六）融合后細(xì)胞培養(yǎng)(1)融合后7—10天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的)后每隔2—3天半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)2—3周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個(gè)大、圓且透明；(4)待集落增殖生長(zhǎng)至1／3孔時(shí)，應(yīng)進(jìn)行抗體檢測(cè)。HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）（七