第六章

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（免疫組化）(immunocytochemistry)

是利用免疫反應(yīng)來定位組織和細(xì)胞中特異大分子的一類技術(shù)

第一節(jié)免疫細(xì)胞化學(xué)原理★

第二節(jié)免疫細(xì)胞化學(xué)方法

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

一、免疫反應(yīng)的特異性

二、免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)

三、抗原

四、抗體

五、標(biāo)記物及其在光鏡和電鏡下可見性第一節(jié)免疫細(xì)胞化學(xué)原理

免疫反應(yīng)的特異性表現(xiàn)在：抗原作為一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子能刺激機(jī)體產(chǎn)生對其特異的抗體并與抗體發(fā)生反應(yīng)

抗體針對某種抗原分子而產(chǎn)生的，特異地識別該抗原并與其結(jié)合

一、免疫反應(yīng)的特異性

免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的原理：

把組織細(xì)胞中的特異分子作為抗原,用在顯微鏡下可見的標(biāo)記物標(biāo)記特異抗體(或者標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物)使特異的免疫化學(xué)反應(yīng)具有可見性,從而間接地顯示抗原,達(dá)到在細(xì)胞或細(xì)胞器水平定位特異分子的目的

二、免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)組織抗原抗體標(biāo)記物

標(biāo)記抗體1熒光2酶3親和技術(shù)4金標(biāo)抗原

免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)過程為：＋標(biāo)記物間接法

直接法

兩種免疫反應(yīng)方法抗原：

凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與抗體特異結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原

抗原性：

物質(zhì)所具有的這種特性稱為抗原性

三、抗原細(xì)胞中具有抗抗原性的化學(xué)學(xué)成分有：蛋白質(zhì)多多肽脂脂蛋白多多糖脂多糖糖糖蛋白白核核蛋白這些生物大分分子都能用免免疫細(xì)胞化學(xué)學(xué)技術(shù)檢測嗎嗎?從生物學(xué)功能能來看都包括括了哪些物質(zhì)質(zhì)?酶、受體、、抗體、細(xì)細(xì)胞外基質(zhì)質(zhì)激素、細(xì)胞胞結(jié)構(gòu)蛋白、、病原體等具有抗原性的的物質(zhì)包括：：四、抗體CCFcFabNNNNCCFab片段具有抗體活性性，決定某種種抗體與抗原結(jié)合的的能力和特異異性Fc片段決定該抗體本本身作為抗原原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體體的能力和特特異性決定其本身抗抗原性抗體的結(jié)構(gòu)免疫細(xì)胞化學(xué)學(xué)技術(shù)中所用用的抗體有兩兩種：抗血清——多克克隆抗體，是是用提純的抗抗原免疫動物后從從動物血清制制備得到的單克隆抗體——是指由由單個產(chǎn)生特特異抗體的Ｂ淋巴細(xì)胞分分化增殖形成成的細(xì)胞克隆產(chǎn)生生的抗體1免疫熒熒光技術(shù)2免疫酶酶技術(shù)3免疫親親和技術(shù)4膠體金金技術(shù)五、標(biāo)記物及及其在光鏡和和電鏡下的可可見性標(biāo)記物使抗體或抗原原抗體復(fù)合物在在各種顯微鏡下下可的物質(zhì)免疫熒光技術(shù)術(shù)將熒光素作為標(biāo)標(biāo)記物使組織細(xì)胞中中形成的抗原原抗體復(fù)合物在熒光顯微鏡下可見，從而而顯示抗原物質(zhì)的定定位（一）免疫熒熒光技術(shù)１.異硫氰酸酸熒光素２２.四乙基基羅達(dá)明３.四甲基異異硫氰酸羅達(dá)達(dá)明４.藻藻紅蛋白▲分子量不同▲最大吸收光譜譜不同▲最大發(fā)射光譜譜不同▲與蛋白結(jié)合方方式不同▲呈現(xiàn)不同的熒熒光：黃綠色熒光橙色熒光橙紅色熒光等熒光素能產(chǎn)生熒光并并能作為染料料的一類化合合物熒光：在激發(fā)光（熒熒光顯微鏡提提供）的照射射下，能發(fā)出出較激發(fā)光波波長更長的可可見光并隨照照射停止而消消失熒光顯微鏡：熒光顯微鏡的的光源提供各各種激發(fā)光，如紫外光、藍(lán)紫紫光（有不同同的波長范圍圍）使受檢標(biāo)本內(nèi)內(nèi)的熒光物質(zhì)質(zhì)發(fā)光是將酶作為標(biāo)記物使組織細(xì)胞中中形成的抗原原抗體復(fù)合物物得到標(biāo)記，，再通過酶細(xì)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)應(yīng)產(chǎn)生顯微鏡鏡下可見的顯顯色物質(zhì)，間間接顯示抗原原物質(zhì)的定位位（二）免疫疫酶技術(shù)1.反應(yīng)產(chǎn)物物定位準(zhǔn)確，，顏色對比清清晰2.反應(yīng)后標(biāo)標(biāo)本材料可長長期保存3.能用于電電鏡觀察免疫酶技術(shù)優(yōu)點：酶抗原一抗二抗酶標(biāo)二抗酶—抗酶抗體體復(fù)合物抗酶抗體酶標(biāo)抗體法抗酶抗體法復(fù)合物法酶標(biāo)記的三種種形式用交聯(lián)劑將酶酶與抗體聯(lián)接接成酶標(biāo)抗體體用于直接法和和間接法酶標(biāo)抗體法用酶免疫動物物獲得抗酶抗抗體，通過二二抗的橋梁作作用把抗酶抗抗體連接在一一抗上,再加加入酶及其底底物，達(dá)到用用酶標(biāo)記抗原原抗體反應(yīng)的的效果由于產(chǎn)生抗酶酶抗體的動物物與產(chǎn)生第一一抗體的動物物是同一種屬屬，兩種抗體體具有相同的的免疫源性，，所以在反應(yīng)應(yīng)中本來針對對一抗的二抗抗也能與抗酶酶抗體結(jié)合抗酶抗體法或或稱酶橋法先獲得抗酶抗抗體并將抗酶酶抗體與酶一一起預(yù)先制成成酶－抗酶抗抗體復(fù)合物在反應(yīng)應(yīng)中，，由二二抗的的橋梁梁作用用把復(fù)復(fù)合物物與一一抗連連接在在一起起最后加加入底底物，，從而而達(dá)到到用酶酶標(biāo)記記抗原原抗體體反應(yīng)應(yīng)的效效果優(yōu)點:1、、抗體體活性性高2、靈靈敏度度高酶－抗抗酶抗抗體復(fù)復(fù)合物物法常用的的標(biāo)記記酶：：1.辣根過過氧化化物酶酶2.堿性性磷酸酸酶常用的的兩種種方法法是：：（1））過氧氧化物物酶標(biāo)標(biāo)記抗抗體法法（2））過氧氧化物物酶-抗過氧化化物酶復(fù)合合物法法（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP））一抗與與組織織抗原原特異異結(jié)合合二抗又又將PAP復(fù)合合物與與第一一抗體體連接接在一一起然后加加入HRP的天天然底底物H2O2和捕捉捉底物物DAB光鏡-棕黃色色反應(yīng)應(yīng)產(chǎn)物物(組織織抗原原的定定位)１.辣辣根過過氧化化物酶酶（hoseradishperoxidase,HRP）２.堿堿性磷磷酸酶酶（Alkalinephosphotase,AKP））堿性磷磷酸酶酶技術(shù)術(shù)常用用的兩兩種方方法：：(1)堿性磷磷酸酶酶標(biāo)記記抗體體(2)堿性磷磷酸酶酶-抗抗堿性性磷酸酸酶復(fù)復(fù)合物物法（（APAAP））（Alkalinephosphotase－－Antialkalinephosphotase））APAAP法的的原理理：以堿性性磷酸酸酶為為標(biāo)記記物,再通通過與與其底底物的的細(xì)胞胞化學(xué)學(xué)反應(yīng)應(yīng)使抗抗原抗抗體反反應(yīng)可可見常用的的底物物是萘萘酚,偶聯(lián)聯(lián)劑是是固藍(lán)藍(lán)、固固紅等等常用于于標(biāo)記記的酶酶：1.辣根過過氧化化物酶酶2.堿性性磷酸酸酶利用兩兩種物物質(zhì)高高度親親和力力而互互相結(jié)結(jié)合定定位特特異分分子親和物物質(zhì)具有多多價能能力的的物質(zhì)質(zhì)，與與親和和物質(zhì)質(zhì)有高高度親和和力又又能與與抗體體、蛋蛋白質(zhì)質(zhì)及各各種標(biāo)標(biāo)記物(熒光光素、、酶、、膠體體金等等)結(jié)結(jié)合最常用用的親親和物物質(zhì)系系統(tǒng)：：1、生物素素（biotin）與與親和素素（avidin）兩者結(jié)結(jié)合能能力為為不可可逆的的2、葡萄球球菌A蛋白白與免疫球球蛋白白IgG（三））親親和細(xì)細(xì)胞化化學(xué)技技術(shù)(1)標(biāo)記親親和素素－生生物素素技術(shù)術(shù)（Labeledavidinbiotin,LAB）(2)橋式親親和素素－生生物素素技術(shù)術(shù)（Bridgedavidinbiotin,BAB））(3)親和素素－生生物素素-酶酶復(fù)合合物技技術(shù)（Avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，，ABC）1.生物素素系統(tǒng)統(tǒng)標(biāo)記記技術(shù)術(shù)的基基本方方法生物素素化酶酶生物素素化抗抗體親和素素—生生物素素—酶復(fù)復(fù)合物物生物素素親和素素生物素素與抗抗體共共價偶偶聯(lián)后后加入入與過過氧化化物酶酶（或或熒光光素））結(jié)合合的親親和素素利用生生物素素－親親和素素之間間的結(jié)結(jié)合，，間接接顯示示組織織細(xì)胞胞中的的抗原原標(biāo)記親親和素素生物物素法法利用親親和素素為橋橋梁連接生生物素素化的的抗體和生生物素素化的的酶橋式親親和素素－生生物素素法親和素素－生生物素素-酶酶復(fù)合合物技技術(shù)親和素素與生生物素素偶聯(lián)聯(lián)的過過氧化化物酶酶組合合成親親和素素－生生物素素－酶復(fù)合合物①特異性性抗體體（一一抗））先與與組織織細(xì)胞胞中的的抗原原結(jié)合合，②生物素素化抗抗體（（二抗抗）再再與一一抗結(jié)結(jié)合③復(fù)合物物與生生物素素化抗抗體結(jié)結(jié)合①→③→②→葡萄球球菌A蛋(StaphylocalproteinA,SPA)◆是金黃色色葡萄球球菌細(xì)胞胞壁含有有的一種種蛋白簡稱為A蛋白或或蛋白A◆SPA能與人及及多種哺哺乳動物物血清中中IgG呈非特異性性結(jié)合又又能與標(biāo)標(biāo)記物結(jié)結(jié)合經(jīng)標(biāo)記的的SPA可代替相相應(yīng)標(biāo)記記的二抗抗2.葡萄球菌菌A蛋白白與IgG系統(tǒng)統(tǒng)親和素（四）免免疫膠膠體金技技術(shù)免疫膠體體金技術(shù)術(shù)是以光光鏡和電電鏡下都都可見的的膠體金金作為抗抗體或ＡＡ蛋白的的標(biāo)記物物，間接接顯示組組織細(xì)胞胞中特異異分子的的技術(shù)膠體金顆顆粒大小小一般在在5--60nm膠體金顆顆粒表面面帶負(fù)電電荷，蛋蛋白質(zhì)表表面帶正正電荷，，蛋白質(zhì)質(zhì)在等電電點或偏偏堿時被被吸附于于金顆粒粒表面,形成一一個蛋白白層阻止止了金顆顆粒的相相互接觸觸，使免免疫金處處于穩(wěn)定定狀態(tài)膠體金對對蛋白質(zhì)質(zhì)的標(biāo)記記:膠體金A蛋白1.免免疫金法法※(ImmunogoldstainingIGS)2.免免疫金銀銀法（Immunogoldsilverstaining,IGSS)3.彩彩色免疫疫金銀法法（ColouredIGSS,CIGSS））免疫膠體體金技術(shù)術(shù)常用方方法免疫金法法一抗與抗抗原結(jié)合合金標(biāo)抗體體或金標(biāo)標(biāo)A蛋作作為二抗與抗原原抗體復(fù)復(fù)合物結(jié)結(jié)合抗原抗體體反應(yīng)部部位在光光鏡下呈現(xiàn)紅紅色，在在電鏡下下呈高電子密密度1、采用不同同大小的的金顆粒粒(通常常5-20nm)標(biāo)記不同同抗體或或A蛋白白，達(dá)到到雙重甚至多重標(biāo)記定位位多種抗抗原的目目的2、金顆粒便便于計數(shù)數(shù)，可對對反應(yīng)作作定量分析析3、可用于透透射、掃掃描電鏡鏡和冷凍凍蝕刻標(biāo)標(biāo)本可將結(jié)果果與光鏡鏡免疫金金技術(shù)結(jié)結(jié)果進(jìn)行行對照免疫交體體金體金金優(yōu)點：免疫細(xì)胞胞化學(xué)技技術(shù)是在在原位檢檢測細(xì)胞胞中抗原原基本過程程:抗抗原固固定↓抗原與抗抗體結(jié)合合反應(yīng)↓標(biāo)記系統(tǒng)統(tǒng)反應(yīng)第二節(jié)免免疫疫細(xì)胞化化學(xué)方法法一、樣品品制備二、抗體體準(zhǔn)備三、基本本實驗過過程四、一些些關(guān)鍵問問題固定光鏡醛醛類固固定,常常規(guī)石蠟蠟包埋和和切片(冷凍切切片→化化學(xué)固定定→免疫疫細(xì)胞化化學(xué)反應(yīng)應(yīng))電鏡4％多多聚甲醛醛為首選選固定劑劑(多聚聚甲醛混混合0.05-0.5%戊二二醛)包埋前技技術(shù)免免疫細(xì)細(xì)胞化學(xué)學(xué)反應(yīng)在在未經(jīng)包埋的組組織片上上進(jìn)行包埋后技技術(shù)免免疫細(xì)細(xì)胞化學(xué)學(xué)反應(yīng)在在超薄切片上進(jìn)進(jìn)行一、樣品品制備抗體制備備：特異異抗體主主要從購購買獲得得(也可自自行制備備特異抗抗血清甚甚至單克克隆抗體體)抗體標(biāo)記記:直接法對每種一一抗進(jìn)行行標(biāo)記，，很少用用間接法對二抗進(jìn)進(jìn)行標(biāo)記記(標(biāo)記二二抗使用用十分普普遍)標(biāo)記抗體體的方法法：1.熒熒光素標(biāo)標(biāo)記抗體體方法2.酶酶標(biāo)記抗抗體3.生生物素化化抗體4.膠膠體金標(biāo)標(biāo)記抗體體或A蛋蛋白二、抗體體準(zhǔn)備免疫細(xì)胞胞化學(xué)方方法有:直直接法、、間接法法間接法中中有:二二抗抗、三抗抗或復(fù)合合物標(biāo)記系統(tǒng)統(tǒng)有:熒熒光光素、酶酶、親和和素膠膠體金觀察方法法有:熒熒光光顯微鏡鏡、普通通光鏡、、電鏡三、基本本實驗過過程切片,丙丙酮固定定，石蠟蠟切片脫蠟復(fù)水1%H2O2/甲醇阻斷內(nèi)源性過過氧化物物酶正常羊血血清(二二抗的正正常血清清)1:20室溫封閉適當(dāng)稀釋釋一抗(兔抗體體)孵育育適當(dāng)稀釋釋二抗(羊抗體體)孵育育適當(dāng)稀釋釋兔PAP復(fù)復(fù)合物孵育0.04%DAB+0.03%H2O2顯色，充分水水洗終止止反應(yīng)蘇木素襯襯染,封片光鏡觀察察棕褐色陽陽性反應(yīng)沉淀淀物過氧化物物酶－抗抗過氧化化物酶復(fù)復(fù)合物法法（PAP法））80nm左右厚度度超薄切切片置于于鎳網(wǎng)上上1-10%H2O2蝕刻1%BSA室溫封閉閉適當(dāng)稀釋釋一抗孵孵育室溫溫1%BSA室溫封閉閉適當(dāng)稀釋釋的10-20nm金標(biāo)A含2%戊二醛/3%多聚甲醛醛固定鈾、鉛染染色電鏡觀察察高電子子密度的的金顆粒粒電鏡包埋埋后膠體體金細(xì)胞胞化學(xué)反反應(yīng)(一)樣品固定定：抗原原和結(jié)構(gòu)構(gòu)的保存存(二)抗體、標(biāo)標(biāo)記物以以及方法法選擇：：單抗、多多抗種種屬關(guān)系系(三)通透處理理：蛋白白酶、表表面活性性劑(四)對照設(shè)設(shè)定：：陰性性、陽陽性、、自身身對照照(五)非特異異反應(yīng)應(yīng)的鑒鑒別和和抑制制：封封閉、、稀釋釋阻阻斷四、一一些關(guān)關(guān)鍵問問題第六章章重重點點一、免免疫細(xì)細(xì)胞化化學(xué)反反應(yīng)原原理把組織織細(xì)胞胞中的的特異異分子子作為為抗原原,用用在在顯微微鏡下下的可可見標(biāo)標(biāo)記物物(或或標(biāo)記記抗原原抗體體復(fù)合合物)標(biāo)記記特異異抗體體,使使特異異的免免疫化化學(xué)反反應(yīng)具具有可可見性性從而間間接地地顯示示抗原原,達(dá)達(dá)到在在細(xì)胞胞或細(xì)細(xì)胞器器水平平定位位特異異分子子的目目的二、簡簡述免免疫細(xì)細(xì)胞化化學(xué)的的直接接法和和間接接法直接法法：組織織抗原原直接接與標(biāo)標(biāo)記的的特異異抗體體反應(yīng)應(yīng)間接法法：抗原與與未標(biāo)標(biāo)記的的特異異抗體體（一一抗））反應(yīng)應(yīng)一抗再再作為為抗原原與標(biāo)標(biāo)記的的第二二抗體體反應(yīng)應(yīng)三、何何謂標(biāo)標(biāo)記物物，包包括哪哪幾種種？標(biāo)記物物：使使抗體體或抗抗原抗抗體復(fù)復(fù)合物物在各各種顯顯微鏡下可可見的的物質(zhì)質(zhì)包括：：1、免免疫疫熒光光技術(shù)術(shù)2、免免疫疫酶技技術(shù)3免免疫親親和技技術(shù)4、膠膠體體金技技術(shù)五、簡述PAP法（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）過氧化化物酶酶-抗抗過氧氧化物物酶復(fù)復(fù)合物物法一抗與與組織織抗原原特異異結(jié)合合二抗又又將PAP復(fù)合合物與與一抗抗連接接在一一起然后加加入HRP的天天然底底物H2O2和捕捉捉底物物DAB光鏡-棕黃色色反應(yīng)應(yīng)產(chǎn)物物(組織織抗原原的定定位)電鏡-與鋨鋨酸反反應(yīng)，，呈高電子子密度度鋨黑黑（超微微結(jié)構(gòu)構(gòu)定位抗抗原））謝謝謝12月-2203:33:3103:3303:3312月-2212月-2203:3303:3303:33:3112月月-2212月月-2203:33:312022/12/313:33:319、靜靜夜夜四四無無鄰鄰，，荒荒居居舊舊業(yè)業(yè)貧貧。。。。12月月-2212月月-22Saturday,December31,202210、雨雨中中黃黃葉葉樹樹，，燈燈下下白白頭頭人人。。。。03:33:3103:33:3103:3312/31/20223:33:31AM11、以我獨獨沈久，，愧君相相見頻。。。12月-2203:33:3103:33Dec-2231-Dec-2212、故人江海別別，幾度隔山山川。。03:33:3103:33:3103:33Saturday,December31,202213、乍見翻疑疑夢，相悲悲各問年。。。12月-2212月-2203:33:3103:33:31December31,202214、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國國見青山。。。31十二二月20223:33:31上上午03:33:3112月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月223:33上上午午12月月-2203:33December31,202216、行動出出成果，，工作出出財富。。。2022/12/313:33:3103:33:3131December202217、做前，，能夠環(huán)環(huán)視四周周；做時時，你只只能或者者最好沿沿著以腳腳為起點點的射線線向前。。。3:33:31上午午3:33上午午03:33:3112月-229、沒有有失敗敗，只只有暫暫時停停止成成功??！。12月月-2212月月-22Saturday,December31,202210、很多事情情努力了未未必有結(jié)果果，但是不不努力卻什什么改變也也沒有。。。03:33:3103:33:3103:3312/31/20223:33:31AM11、成功就就是日復(fù)復(fù)一日那那一點點點小小努努力的積積累。。。12月-2203:33:3103:33Dec-2231-Dec-2212、世間成成事，不不求其絕絕對圓滿滿，留一一份不足足，可得得無限完完美。。。03:33:3103:33:3103:33Saturday,December31,202213、不知香積寺寺，數(shù)里入云云峰。。12月-2212月-2203:33:3103:33:31December31,202214、意志志堅強(qiáng)強(qiáng)的人人能把把世界界放在在手中中像泥泥塊一一樣任任意揉揉捏。。31十十二二月20223:33:31上上午03:33:3112月月-2215、楚楚塞塞三三湘湘接接，，荊荊門門九九派派通通。。。。。十二二月月223:33上上午午12月月-2203:33December31,202216、少少年年十十五五二二十十時時，，步步行行奪奪得得胡胡馬馬騎騎。。。。2022/12/313: